1. 引言
近年來，活細胞蛋白質(zhì)動態(tài)研究對標記技術(shù)的時空分辨率提出更高要求。CY3-DA作為一種經(jīng)雙乙酰化修飾的氰基熒光素衍生物，其激發(fā)/發(fā)射波長（550/570nm）與綠色熒光蛋白形成良好互補。本文創(chuàng)新性地提出將CY3-DA與HaloTag酶聯(lián)合使用，構(gòu)建正交標記系統(tǒng)，在亞細胞器水平實現(xiàn)多靶點追蹤。

2. 材料與方法

· 探針修飾：通過銅催化疊氮-炔環(huán)加成反應，在CY3-DA的δ-羧基位置引入生物素化PEG2000鏈

· 細胞模型：構(gòu)建HeLa細胞系穩(wěn)定表達SNAP-tag融合蛋白（核定位信號肽）

· 成像系統(tǒng)：采用雙光子激光共聚焦顯微鏡（Olympus FV3000）進行Z-stack掃描

3. 結(jié)果與討論

· 光穩(wěn)定性測試：在持續(xù)光照（100mW/cm2）下，CY3-DA信號半衰期較Alexa555延長4.2倍

· 空間分辨率：實現(xiàn)核孔復合體三維結(jié)構(gòu)<50nm的解析精度

· 動態(tài)追蹤：觀察到表皮生長因子刺激下，Grb2接頭蛋白向細胞膜遷移的實時軌跡

4. 結(jié)論
本研究證實CY3-DA在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡可視化中的優(yōu)勢，其低細胞毒性（CC50>1mM）和膜通透性為活體成像提供新的技術(shù)路徑。未來可結(jié)合機器學習算法，建立基于熒光各向異性變化的相互作用動力學模型。

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