還原糖檢測(cè)試劑盒(斐林比色法)
一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
斐林試劑(Fehling's Reagent)又稱菲林試劑或裴林試劑，是德國(guó)化學(xué)家Hermann vonFehling 1849年所發(fā)明，斐林試劑與班氏試劑(Benedict's Reagent)相似，均是用來(lái)檢測(cè)還原糖的存在，其原理是與可溶性的還原性糖(葡萄糖、果糖和麥芽糖)在加熱的條件下，能夠生成磚紅色的氧化亞銅沉淀。
還原糖檢測(cè)試劑盒(斐林比色法)主要由酒石酸鈉鉀、硫酸銅等組成，其測(cè)定原理是還原糖具有醛基和酮基，在堿性溶液中煮沸能把斐林試劑中的Cu"*還原成Cu*，使藍(lán)色的斐林試劑脫色，脫色程度與溶液中還原糖含量成正比，在590nm下可用比色法測(cè)定吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出樣品中還原糖的含量，主要用于含淀粉食品、飲料、碳酸飲料、肉制品、蜜餞等食品和植物等樣品中還原糖的定量檢測(cè)，總糖的含量也可以測(cè)定，但需要提前水解后才能檢測(cè)，也可用于還原糖的定性試驗(yàn)。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。
二、產(chǎn)品組成：
名稱 | 50T | 100T | Storage |
試劑(A): Glu標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml) | 30ml | 50ml | 4℃ |
試劑(B):Fehling's Reagent A | 50ml | 100ml | RT |
試劑(C): Fehling's Reagent B | 50ml | 100ml | RT，避光 |
試劑(D):甲基紅指示劑 | 10ml | 20ml | RT |
試劑(E): pH中和液(10×) | 50ml | 100ml | RT |
三、自備材料：
1、試管或離心管
2、錐形瓶、容量瓶、玻璃珠3、水浴鍋或酒精燈
4、果糖、轉(zhuǎn)化糖等還原糖標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml)
5、鹽酸水溶液、氫氧化鈉溶液
6、10%乙酸鉛溶液、飽和硫酸鈉溶液
7、蒸餾水、碘液
8、分光光度計(jì)、比色皿
四、操作步驟(僅供參考)：
1、配置斐林試劑:Fehling's Reagent A液和B液等比例混合即成，不可久置。2、配置pH中和液(1×): pH中和液(10×)和水按1:9比例混合即成。
3、樣品中還原糖的提取∶
1)固體樣品(如含淀粉食品、植物樣品等):稱取粉碎或混勻后的試樣10~20g(精確到0.01g )，置于250ml容量瓶，當(dāng)體積接近150ml時(shí)滴加1~3滴甲基紅指示劑，如呈紅色可用pH中和液調(diào)至微黃色;若用風(fēng)干樣品，可稱取3g直接加入容量瓶，加入少量水濕潤(rùn)后再加水至150ml左右加入指示劑和中和液﹔將容量瓶置于80℃的恒溫水浴中保溫30min，期間搖動(dòng)數(shù)次，以便將還原糖充分提取出來(lái)。對(duì)于含蛋白質(zhì)較多的樣品，此時(shí)可加入乙酸鉛溶液除去蛋白質(zhì)，至不再產(chǎn)生白色絮狀沉淀時(shí)，加入飽和的硫酸鈉溶液除去多余的鉛離子，30min后取出冷卻并定容至刻度，搖勻后取濾液備用。
2)酒料︰稱取混勻后的試樣100g(精確到0.1g )，置于蒸發(fā)皿上，滴加1~3滴甲基紅指示劑，用pH中和液調(diào)至微黃色，在水浴上蒸發(fā)至原體積的1/4后，移入250ml容量瓶，置于80℃的恒溫水浴中保溫30min，期間搖動(dòng)數(shù)次，含蛋白質(zhì)較多的樣品參考上述方法，濾液備用。
3)碳酸飲料︰稱取混勻后的試樣100g(精確到0.1g )，置于蒸發(fā)皿上，在水浴上微微攪拌除去二氧化碳后，移入250容量瓶，用水洗滌蒸發(fā)皿并入容量瓶，加水至刻度，混勻后備用。4)總糖的水解和提取∶稱取植物樣品0.5~3g，剪碎，加入蒸餾水約3ml勻漿，轉(zhuǎn)移至三角燒瓶，用12ml蒸餾水沖洗研磨器2~3次沖洗液也轉(zhuǎn)移至燒瓶中,向三角燒瓶中加入10ml6M鹽酸溶液，搖勻，煮沸30min，并不時(shí)攪拌;取2滴加于小離心管，再滴加1滴碘液，檢查水解是否，如已經(jīng)水解，則不顯示藍(lán)色;水解完畢后冷卻至室溫，滴加6M氫氧化鈉溶液，使溶液pH接近中性;含蛋白質(zhì)較多的樣品參考上述方法，濾液或上清液用蒸餾水定容至100ml，混勻，取10ml，用蒸餾水定容至100ml，搖勻備用。
3、制作還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:按下表設(shè)置空白管(0號(hào))、梯度標(biāo)準(zhǔn)管(1~6號(hào))，按順序依次加入。
加入物質(zhì)(ml) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
Glu標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml) | 0 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 |
蒸餾水 | 3 | 2.5 | 2 | 1.5 | 1 | 0.5 | 0 |
葡萄糖含量（mg） | 0 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 |
斐林試劑 | 2 | ||||||
將各管混勻后，用沸水浴加熱 15min，冷水或自來(lái)水冷卻，2500r/min離心5~10min,取上清，1cm比色皿，空白管調(diào)零，用分光光度計(jì)測(cè)590nm的吸光度值，以各標(biāo)準(zhǔn)管吸光度為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4、樣品還原糖的測(cè)定︰吸取準(zhǔn)備好的還原糖提取液3ml，加入2ml斐林試劑，混勻，沸水浴加熱15min，冷卻、離心、取上清、測(cè)定等操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線，空白管調(diào)零后用樣品管的吸光度值帶入回歸方程即可計(jì)算出樣品中還原糖的含量。
結(jié)果計(jì)算∶
樣品還原糖含量(%)=m×V×N/(mo×Vs×1000)×100
式中:
m=樣品中還原糖的含量(mg)
V=提取液總體積(ml)
N=稀釋倍數(shù)
mo=樣品質(zhì)量(g)
Vs=測(cè)定時(shí)取用的提取液體積(ml)
1000=單位換算系數(shù)。
附:還原糖的定性試驗(yàn)
1、配制斐林試劑工作液︰臨用前，取適量Fehling's ReagentA液和B液等量混合即成，即配即用。
2、向潔凈試管中加入1~2ml待測(cè)樣品。
3、向該試管中加入1ml斐林試劑工作液，充分搖勻。4、將上述混合液置于沸水浴中，并持續(xù)1~3min。
5、觀察試管內(nèi)混合液顏色是否發(fā)生變化，其顏色變化順序應(yīng)為淺藍(lán)色-棕色-磚紅色(沉淀)。
鑒定結(jié)果：
還原性糖(如核糖、葡萄糖、果糖等) | 磚紅色沉淀 |
非還原性糖(蔗糖、淀粉等) | 無(wú)顏色變化 |
注意事項(xiàng):
1、樣品提取液中還原糖濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再行測(cè)定。
2、樣品提取液中還原糖濃度過(guò)低時(shí)，可提高樣品的濃度或增加提取液的用量。
3、可合理減少或增加提取液和斐林試劑的用量。
4、斐林試劑的A、B液必須分開(kāi)儲(chǔ)存，臨用前按要求混合使用。
5、斐林試劑B液呈強(qiáng)堿性，需小心操作。
6、6M鹽酸配制∶用市售鹽酸和蒸餾水或去離子水等比例混合即成6M鹽酸，該過(guò)程會(huì)放熱，應(yīng)小心操作，避免傷人。
7、6M氫氧化鈉配制︰稱取氫氧化鈉24g溶解于蒸餾水，補(bǔ)至100ml即成;氫氧化鈉溶于水會(huì)放熱，應(yīng)小心操作，避免傷人。
8、色素對(duì)糖類的測(cè)定存在干擾，當(dāng)提取液顏色較深時(shí)，應(yīng)事先脫色后再進(jìn)行測(cè)定，不同樣品脫色方法和脫色劑用量不同，需自行查找文獻(xiàn)資料，5%活性炭可用于紅葡萄酒的脫色。9、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
有效期∶6個(gè)月有效。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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