PriCells: 人真皮復(fù)合培養(yǎng)法

實驗材料：

1. 早產(chǎn)兒或死亡胎兒的皮膚，也可用手術(shù)取下的成體皮膚

2. 1000000U/L中性蛋白酶，0.25%胰蛋白酶

3. MEM和HBSS混合液，添加20mmol/L HEPES、200000IU/L青霉素和200mg/L鏈霉素和1.59g/L慶大霉素，HBSS

4. 手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷

5. 不銹鋼網(wǎng)

6. 離心管（15ml、50ml）

實驗方法：

1. 真皮的制備

（1） 取厚1.5mm的皮片，放入4℃用MEM和HBSS混合液浸洗，切成6cm×2cm的皮條。

（2） 在培養(yǎng)皿中加入HBSS，然后放皮條，使真皮面朝下，皮片漂浮其中。在37℃條件下，孵育8-10d，每3d換液1次。

（3） 用眼科鑷將真皮與表皮分離，將真皮切成0.5cm2小片。將真皮植塊表皮面朝上放入培養(yǎng)皿中。

（4） 在-80℃和37℃下反復(fù)凍融植塊10次，以去除存活的細胞成分，從而形成以膠原纖維網(wǎng)架為主的真皮組織，作為以后角質(zhì)形成細胞生長的支持物，然后將真皮植塊在-80℃下冷凍保存。

2. 復(fù)合培養(yǎng)

（1） 在37℃水浴中融化凍存的真皮植塊，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，使真皮乳頭面朝上。加入5ml培養(yǎng)液，在37℃條件下孵育過夜。

（2） 將角質(zhì)形成細胞種植到真皮植塊上，培養(yǎng)12h。

（3） 角質(zhì)形成細胞貼附于真皮植塊后，將復(fù)合培養(yǎng)的植塊轉(zhuǎn)移到無菌的不銹鋼網(wǎng)上，移至新的培養(yǎng)皿內(nèi)。

（4） 加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的量不能超過不銹鋼網(wǎng)高度，讓表面的角質(zhì)形成細胞暴露于空氣當中，促進細胞分化。在加液過程中要防止氣泡形成，以免破壞液氣界面。

3. 結(jié)果分析

在真皮上復(fù)合培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞分化能力良好，可分化形成明顯的棘細胞層、顆粒細胞層和角質(zhì)細胞層等表皮結(jié)構(gòu)。

4. PriCells-原代內(nèi)皮細胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基

5. PriCells-原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)特制添加劑

6. PriCells-原代細胞分離試劑盒

7. PriCells-原代細胞鑒定試劑盒