所謂永生化是細(xì)胞生物學(xué)術(shù)語,指動物細(xì)胞因脫分化失敗,受到病毒感染、外源惡意代碼轉(zhuǎn)染、輻射或藥劑作用后,細(xì)胞分裂次數(shù)限制機(jī)制和DNA檢查自毀機(jī)制失靈,導(dǎo)致具有無限分裂生長能力的過程。

永生化細(xì)胞則是指細(xì)胞獲得持續(xù)生長增殖能力的特性,永生化的細(xì)胞具有無限增殖生長性，可長期傳代，并多伴有核型改變,細(xì)胞永生化是癌變的必經(jīng)途徑。由于正常組織來源的原代細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下雖可生長和分裂,但經(jīng)過有限次的細(xì)胞傳代后，就會停止增殖,發(fā)生衰老和死亡，限制了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用,因此有學(xué)者通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因?qū)四康募?xì)胞內(nèi)，如病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等,以增加永生化的發(fā)生率,進(jìn)而建立永生化細(xì)胞株(immortalized cellstrains)以達(dá)到使體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有無限增殖能力,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間無差異的目的。

永生化細(xì)胞策略：

方法A：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白（TERT）表達(dá)

TERT蛋白是端粒酶的催化亞基，在大多數(shù)體細(xì)胞中通常不活躍。在這種方法中，您可以將編碼人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）蛋白的cDNA插入到您感興趣的原代細(xì)胞中。當(dāng)hTERT被外源性表達(dá)時，細(xì)胞能夠維持足夠的端粒長度以避免衰老。這是最近開發(fā)用于細(xì)胞永生化的方法。

優(yōu)點(diǎn)：

1、對于受端粒長度影響Z大的細(xì)胞（例如人類細(xì)胞）的永生化效果很好

2、Z不可能引起類似癌癥的表型

3、使用此方法生成的細(xì)胞系具有穩(wěn)定的基因型并保留關(guān)鍵的表型標(biāo)記

缺點(diǎn)：

1、與方法B相比，某些細(xì)胞類型的永生化成功率可能不高

2、hTERT的過度表達(dá)甚至可以在某些細(xì)胞類型（例如上皮細(xì)胞）中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡

3、僅使用這種方法可能不足以成功實(shí)現(xiàn)永生化

方法B：病毒致癌基因

病毒致癌基因，如SV40病毒的大T抗原或HPV的E6/E7致癌基因，可以通過抑制腫瘤抑制基因（例如p53和Rb）來實(shí)現(xiàn)永生化。這種方法比方法A更快地生效，但可能會改變一些細(xì)胞的特性。

優(yōu)點(diǎn)：

1、永生化的Z快速途徑

2、對于難以永生化的原代細(xì)胞（例如上皮細(xì)胞）很有用

缺點(diǎn)：

1、可能會改變細(xì)胞的特性（例如失去接觸抑制，基因組不穩(wěn)定性，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的破壞）

2、僅使用這種方法可能不足以成功實(shí)現(xiàn)永生化

在許多情況下，單獨(dú)使用方法A和B可能不足以成功實(shí)現(xiàn)永生化。最近的研究發(fā)現(xiàn)，共同表達(dá)hTERT和病毒致癌基因具有更高的成功率，并產(chǎn)生更真實(shí)和正常的細(xì)胞模型，具有明確定義的遺傳背景。

艾美捷總結(jié)了一些常見的永生化方法，每種機(jī)制都涉及破壞圖中顯示的復(fù)制過程中的關(guān)鍵基因。

試劑 機(jī)制 ABM可提供的形式

SV40T Antigen Suppresion of p53 and Rb genes Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus

p53 siRNA Knockdown of p53 tumor suppression gene siRNA Lentivirus

Rb siRNA Knockdown of Rb tumor suppression gene siRNA Lentivirus

Ras Suppression of Rb Lentivirus

C-myc T58A Suppression of p53 Lentivirus

Bmi1 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus

CDK4 Suppression of p16/Rb pathway Lentivirus

HPV 16 E6/E7 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus

EBV Viral oncogene -

hTERT Elongation of telomeres Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus