今天想給大家介紹另一種分泌型細胞因子的檢測方法，也就是ELISPOT技術(shù)，它是目前用于細胞因子檢測靈敏的實驗方法。
01
Enzyme-linked Immunospot Assay，即ELISPOT，全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測。該技術(shù)同時結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA技術(shù)），能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況（ELISPOT實際上是雙夾心ELISA的延伸和發(fā)展，可以看作單細胞水平的ELISA）。該技術(shù)的優(yōu)點在于：①靈敏度高，較傳統(tǒng)ELISA靈敏度高2-3個數(shù)量級；②單細胞水平評價活細胞功能；③操作簡單，可進行高通量篩選。
ELISPOT常見的應用領(lǐng)域包括：T/B細胞功能研究、自身免疫檢測、yizhi、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測、腫瘤研究、傳染病的研究和檢測、病毒研究等。ELISPOT技術(shù)最初用于B淋巴細胞分泌抗體的檢測。由于B細胞分泌的抗體量一般較大，容易檢測，即使早期ELISPOT檢測靈敏度不高，但是用于抗體檢測還是綽綽有余。后面隨著技術(shù)的進步，ELISPOT檢測的靈敏度越來越高，因此被更多地用于痕量細胞因子的檢測。ELISPOT用于T細胞功能評價時，能夠區(qū)分活化的T細胞亞群，例如，Th1細胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2和TNF-α，Th2細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13等。目前利用ELISPOT檢測T細胞分泌IFN-γ的實驗已經(jīng)得到非常廣泛的應用，尤其在疫苗有效性評價中具有重要意義，原因：① IFN-γ與CD8 T細胞的溶細胞活性密切相關(guān)；② CD4 T細胞參與的細胞毒性免疫反應會產(chǎn)生IFN-γ。
02
ELISPOT實驗原理
ELISPOT實驗原理如圖1：
a：ELISPOT 實驗在96孔板上進行，使用 PVDF 膜作為基質(zhì)，膜上包被特異性的單克隆抗體（抗體須無毒，不含內(nèi)毒素，親和力高），以捕獲細胞分泌的細胞因子。
b：待測細胞和刺激物（抗原或絲裂原）在板內(nèi)進行共培養(yǎng)，此時待測細胞分泌的細胞因子能夠被包被在膜上的抗體特異性地捕獲。
c：去除細胞后，加入生物素標記的二抗，可與被捕獲的細胞因子相結(jié)合。
d：然后加入酶標親和素與生物素結(jié)合，進行化學酶聯(lián)顯色反應，此時可以在膜的局部形成一個個圓形斑點e，一個斑點對應當初一個分泌細胞因子的細胞。
e：特異性抗原再刺激引流淋巴結(jié)細胞9天進行小鼠IFN-γ ELISPOT檢測結(jié)果。
陽性細胞率%=膜斑點數(shù)/加入孔內(nèi)的細胞總數(shù)×100%
圖1 ELISPOT技術(shù)檢測原理[1]
注：也可以直接使用熒光素標記二抗與細胞因子進行結(jié)合反應，此時不再需要進行化學發(fā)光顯色，可以一次檢測多種細胞因子。但是作為膜板材質(zhì)的NC膜和PVDF膜具有自發(fā)熒光的問題，會造成檢測結(jié)果背景升高。
實驗所使用的的配對抗體對于斑點形成的靈敏度具有重要影響，以下兩圖列出了小鼠和人進行細胞因子ELISPOT實驗文獻中推薦使用的配對抗體?？贵w可以從多種商業(yè)途徑獲得，包括eBiosciences、Biolegend、BD Biosciences和Thermo Scientific等。
圖2 小鼠細胞因子ELISPOT實驗推薦使用的配對抗體[1]
圖3 人細胞因子ELISPOT實驗推薦使用的配對抗體[1]
以下過程1（抗原包被）和2（細胞培養(yǎng)）必須在無菌條件下進行，過程3（細胞因子檢測）在常規(guī)條件下操作即可。我們也可以用ELISPOT實驗檢測分泌特異性抗體的B細胞，該過程的原理和步驟與細胞因子ELISPOT測定相同，不同之處在于需要使用特異性抗原（例如肽或蛋白質(zhì)，1-20 μg/mL）而非抗體包被ELISPOT板。
（1）準備無菌的96孔PVDF膜ELISPOT板，每孔加入50 μL 70%的乙醇溶液，室溫孵育30 s。
注：在PVDF膜之前，經(jīng)常使用的是硝酸纖維素膜。大家都知道PVDF膜和NC膜是我們進行WB實驗常用的兩種蛋白結(jié)合膜，其中PVDF膜比NC膜具有更優(yōu)的蛋白吸附性能，更精細的顯色條帶分辨率。但是由于疏水性問題，PVDF膜使用前常需要用酒精活化，增強其蛋白結(jié)合能力（潤濕后PVDF膜由潔白不透明變成暗色半透明狀）。
（2）棄乙醇溶液，每孔以200 μL無菌PBS洗滌3次，盡量減少乙醇殘留。
注：本實驗所用的所有PBS溶液均不含鈣、鎂離子。在進行移液操作時，移液槍應沿著孔壁接近孔底的地方加入，不能直接對著膜垂直加入或者觸碰到膜，減少膜可能的破損。此外，若在高壓/高速下往孔中添加或移除溶液，可能導致孔的背景顏色不均勻。因此后面在洗滌膜板時，通常是將膜板浸入水中而不是直接利用流動的水進行沖洗。
（3）96孔板每孔加入抗體溶液50 μL（無菌PBS稀釋至適宜濃度），蓋上板蓋置于濕盒中（可減少抗體溶液揮發(fā)），4℃包被過夜。
注：內(nèi)毒素對ELISPOT實驗的結(jié)果會產(chǎn)生很大的影響，即使是微量的內(nèi)毒素也能非特異性刺激T淋巴細胞，促進細胞因子的分泌。實驗中內(nèi)毒素的來源主要是各種試劑。此外，血清除了含有內(nèi)毒素之外還可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影響最終斑點的形成，使用無血清ELISPOT技術(shù)可以避免其影響。文獻[1]在培養(yǎng)小鼠細胞時使用的是HL-1培養(yǎng)基，培養(yǎng)人細胞時使用的是CTL-Test培養(yǎng)基。
以下過程1（抗原包被）和2（細胞培養(yǎng)）必須在無菌條件下進行，過程3（細胞因子檢測）在常規(guī)條件下操作即可。我們也可以用ELISPOT實驗檢測分泌特異性抗體的B細胞，該過程的原理和步驟與細胞因子ELISPOT測定相同，不同之處在于需要使用特異性抗原（例如肽或蛋白質(zhì)，1-20 μg/mL）而非抗體包被ELISPOT板。
（1）準備無菌的96孔PVDF膜ELISPOT板，每孔加入50 μL 70%的乙醇溶液，室溫孵育30 s。
注：在PVDF膜之前，經(jīng)常使用的是硝酸纖維素膜。大家都知道PVDF膜和NC膜是我們進行WB實驗常用的兩種蛋白結(jié)合膜，其中PVDF膜比NC膜具有更優(yōu)的蛋白吸附性能，更精細的顯色條帶分辨率。但是由于疏水性問題，PVDF膜使用前常需要用酒精活化，增強其蛋白結(jié)合能力（潤濕后PVDF膜由潔白不透明變成暗色半透明狀）。
（2）棄乙醇溶液，每孔以200 μL無菌PBS洗滌3次，盡量減少乙醇殘留。
注：本實驗所用的所有PBS溶液均不含鈣、鎂離子。在進行移液操作時，移液槍應沿著孔壁接近孔底的地方加入，不能直接對著膜垂直加入或者觸碰到膜，減少膜可能的破損。此外，若在高壓/高速下往孔中添加或移除溶液，可能導致孔的背景顏色不均勻。因此后面在洗滌膜板時，通常是將膜板浸入水中而不是直接利用流動的水進行沖洗。
（3）96孔板每孔加入抗體溶液50 μL（無菌PBS稀釋至適宜濃度），蓋上板蓋置于濕盒中（可減少抗體溶液揮發(fā)），4℃包被過夜。
注：內(nèi)毒素對ELISPOT實驗的結(jié)果會產(chǎn)生很大的影響，即使是微量的內(nèi)毒素也能非特異性刺激T淋巴細胞，促進細胞因子的分泌。實驗中內(nèi)毒素的來源主要是各種試劑。此外，血清除了含有內(nèi)毒素之外還可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影響最終斑點的形成，使用無血清ELISPOT技術(shù)可以避免其影響。文獻[1]在培養(yǎng)小鼠細胞時使用的是HL-1培養(yǎng)基，培養(yǎng)人細胞時使用的是CTL-Test培養(yǎng)基。
圖4 ELISPOT實驗過程總覽[2]
（1）棄去抗體包被液，每孔以200 μL無菌PBS洗滌3次，最后一次棄去液體后，輕輕在無菌吸水紙上扣干。（2）封閉：每孔加入200 μL含1% BSA的PBS溶液（以0.22 μm濾膜過濾），室溫封閉2 h。
（3）棄去封閉液，每孔以200 μL無菌PBS洗滌1次，輕輕在無菌吸水紙上扣干。（膜板不用時可在4℃保存數(shù)周）
注：后續(xù)若是使用的是過往封閉的膜板，每孔可以加入200 μL細胞培養(yǎng)基于室溫下靜置10 min。棄培養(yǎng)基后，重復該操作一次，再棄培養(yǎng)基，扣干后進行后續(xù)實驗操作。
（4）組別設(shè)計：① 陰性對照孔：100 μL培養(yǎng)基+100 μL細胞；② 細胞樣品孔：100 μL培養(yǎng)基稀釋的適宜濃度刺激物+100 μL細胞；③ 陽性對照：100 μL陽性對照刺激物+100 μL細胞（常用陽性對照刺激物類型及濃度見文末附1和2）；④背景對照孔：不含細胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測試劑。
注1：細胞加入之后，不宜再震動或拍擊ELISPOT板，震動或拍擊反而會促進細胞成圈分布在孔的外周。同時ELISPOT板之間不能疊放，疊放會引起整塊板溫度不均勻，導致四周溫度較高的邊緣效應。
注2：細胞狀態(tài)對ELISPOT檢測結(jié)果具有重要意義。細胞狀態(tài)好、活力高、功能保持完整，那么檢測獲得的結(jié)果必然好。因此在進行ELISPOT檢測時要盡可能保證細胞處于良好的生長狀態(tài)。對于新鮮分離的原代細胞，需要盡可能減少分離過程中的機械損傷以及有毒化學物質(zhì)對細胞的損害。對于凍存后復蘇的細胞，通常較難保證細胞的生長狀態(tài)，因此對細胞凍存過程提出了更嚴格的要求。
圖5 樣品孔設(shè)置舉例（實驗目的：基于ELISpot的方法來測量小鼠樣品中卵清蛋白特異性CD4+和CD8+T細胞）[2]
圖注：Media為培養(yǎng)基＋DMSO，DMSO 濃度和陽性對照終濃度一致；CD4/CD8 epitope是本實驗所用的抗原刺激物。該實驗以Con A（刀豆蛋白）作為陽性對照，CoA是一種非特異性有絲分裂原，理論上可在一定程度上刺激所有樣品，允許我們確認所有樣品均含有活細胞。若陽性對照的響應十分強烈，為節(jié)約板空間，不需要對所有樣品進行CoA質(zhì)控。（5）加完所有樣品后，蓋上板蓋，在5%CO2 、37℃條件下培養(yǎng)18-24 h，培養(yǎng)期間不要晃動或移動孔板。為防止液體蒸發(fā)，96孔板可以使用鋁箔紙包裹。注：板的碰撞或移動會造成細胞移位，進而導致斑點模糊、拖尾、一個細胞生成多個斑點等現(xiàn)象。對于IFN-γ檢測通常培養(yǎng)20 h，Th1和Th17細胞因子培養(yǎng)24 h，Th2細胞因子和GM-CSF培養(yǎng)48 h，總之要確保每次細胞因子檢測培養(yǎng)時長的一致性。
（1）棄去孔內(nèi)的混合培養(yǎng)液，每孔加入200 μL冰冷的去離子水，在冰浴上孵育10 min。孵育結(jié)束后，每孔用200 μL PBST（含0.05%Tween的PBS溶液）溶液洗滌5次，以除去細胞和未結(jié)合的細胞因子。最后一次棄去液體后，輕輕在吸水紙上扣干。
注：無菌水孵育的目的在于，利用低滲作用誘導細胞膨脹和裂解，使其在后續(xù)的洗滌過程中更容易被去除，否則會影響最終斑點的形成。（2）每孔加入100 μL生物素標記的二抗（以含0.5%BSA或FCS的PBS稀釋至適宜濃度，并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾），室溫條件下孵育1-2 h。
（3）孵育結(jié)束后，每孔以200 μL PBST溶液洗滌5次，洗滌最后一次時，將PVDF膜板背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，輕輕在吸水紙上扣干。
注：洗滌膜板背面時，可以將膜板浸入裝有PBST溶液的容器中，輕輕晃動幾次，待膜背面和塑料保護層上的液體甩干之后，再將其合攏，切忌傷害到膜。該步驟之后，若不立即進行斑點顯影檢測，ELISPOT板可在4℃條件下保存過夜甚至一周。（4）每孔加入100 μL堿性磷酸酶（ALP）或辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素（streptavidin）或外源性抗生物素蛋白（ExtrAvidin）（以含1%BSA的PBST溶液稀釋），室溫孵育1 h。
（5）酶底物顯色：每孔加入200 μLPBST溶液洗滌5次，洗滌最后一次時，將PVDF膜板背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，輕輕在吸水紙上扣干。隨后每孔加入100 μL BCIP/ NBT（用于ALP）或100 μL AEC（用于HRP）顯色液，用鋁箔覆蓋膜板避光。
注：同時洗滌膜的兩側(cè)可以減少試劑試劑泄露導致的高背景染色。顯色反應通常發(fā)生在10-30 min，通過目視監(jiān)測斑點的形成過程。
（6）待斑點生長到合適大小，以去離子水洗滌2次，終止顯色反應。將板倒扣在吸水紙上，拍干細小的水珠，之后取下保護層，放在通風的地方，室溫靜置10-30 min，讓膜自然晾干。
注：此處洗滌建議將膜板浸泡在盛滿持續(xù)流動水的容器中進行，而不是直接利用流動的水進行沖洗，并且需要同時洗滌膜板正反面。
（7）將ELISPOT板置于自動讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)后，進行斑點計數(shù)并作統(tǒng)計分析[3]。
注：斑點計數(shù)時，應注意區(qū)分由纖維、膜撕裂、碎片等導致的不規(guī)則斑點，一般細胞生成的斑點通常為圓形。
附1：實驗所用的刺激物（抗原）類型[4]：
① Freeze and Thaw lysate（細胞凍融產(chǎn)物）
② Class I and Ⅱ Peptides（I類和Ⅱ類肽）
③ Recombinant proteins（重組蛋白）
④ RNA
⑤ Recombinant virus vectors （重組病毒載體）通刺激物的選擇應該遵循“成分盡可能簡單、純度盡可能高"的原則。特異性刺激物T細胞表位肽，無需APC的內(nèi)化和加工，可直接被遞呈給T細胞，每一條T細胞表位肽都有相對應的MHC分子，代表了一種特異性的細胞免疫。但是由于涉及到MHC分子類型匹配的問題，若不知道實驗對象的MHC類型，可能需要多選擇幾個T細胞表位肽，驗證實驗效果。其次推薦使用重疊多肽池，在潛在的T細胞表位肽附近合成一系列的重疊多肽，混合成多肽池，也能對特異性的細胞免疫應答做出有效刺激。國際上通用的標準陽性刺激物CEF就是這樣一個T細胞表位肽池，有32條多肽混合而成，分別取自于人類巨細胞病毒（CMV）、人類皰疹病毒（EBV）和流感病毒。其他非特異性刺激物還有植物血凝素（PHA）、脂多糖（LPS）和刀豆蛋白A（ConA）如下圖。
在臨床前研究評估疫苗佐劑時，卵清蛋白（OVA）通常被用作模型抗原。原因是：① 單獨使用時，OVA具有固有的弱免疫原性；② 不同品系小鼠呈遞的OVA抗原表位目前已經(jīng)清晰。
圖注：來自免疫小鼠脾細胞的IFN-γ+斑點形成細胞。C57BL/6小鼠在第0天和第21天單獨用OVA（10 μg）或聯(lián)合明礬（40 μg）+ CpG 1826（10 μg）佐劑進行肌肉注射誘導免疫反應。在第28天收集脾細胞，用IFN-γ ELISpot分析OVA特異性CD4 T細胞。代表性結(jié)果如圖a-d。a, b：經(jīng)OVA免疫后分離的小鼠細胞在板中分別用培養(yǎng)基或2 μg/mL ISQAVHAAHAEINEAGR（CD4 Epitope）進行刺激。c, d：經(jīng)OVA+明礬/CpG聯(lián)合免疫后分離的小鼠細胞在板中分別用培養(yǎng)基或2 μg/mL ISQAVHAAHAEINEAGR進行刺激。
在前面的實驗步驟中，我已經(jīng)盡可能羅列了各步操作中應當注意的事項，在此根據(jù)文獻[5]對相關(guān)內(nèi)容再做補充，希望幫助大家拿下這個實驗。
（1）血液樣本：血樣收集時推薦使用肝素抗凝，EDTA-K2抗凝時會對部分酶產(chǎn)生抑制作用，尤其可以抑制ALP酶活（EDTA螯合了ALP酶活性所需要的Mg2+）。（2）血樣儲存和轉(zhuǎn)移：建議在室溫避光條件下儲存和轉(zhuǎn)運血樣，如此可維持PBMC中CD4和CD8細胞功能至少24 h（活性在90%以上）。（3）培養(yǎng)基：切忌使用未經(jīng)測試的血清。血清除了含有內(nèi)毒素之外還可能含有其它未知的ELISPOT敏感性成分，影響最終斑點的形成。因此建議使用ELISPOT專用的無血清培養(yǎng)基進行細胞凍存、復蘇、洗滌以及其它相關(guān)操作。（4）細胞儲存：細胞梯度冷卻后應在48 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至液氮中保存。即使是短期儲存，也不建議將細胞保存在-80℃，否則會引起細胞功能逐漸喪失。（5）PBMC過夜培養(yǎng)與計數(shù)：重新復蘇的PBMC給予過夜培養(yǎng)，有助于細胞功能恢復。細胞數(shù)目會造成實驗結(jié)果的可變性，臺盼藍染色法在該實驗中存在不足：該染色會將部分凋亡的細胞統(tǒng)計在內(nèi)，但是這部分細胞在后續(xù)進行ELISPOT實驗會。染料應當能夠準確區(qū)分活、死和凋亡細胞，反映PBMC樣本的總體質(zhì)量。有必要時PBMC可經(jīng)DNase洗滌除亡細胞釋放的DNA裂解物，提高計數(shù)準確性。（6）乙醇預潤濕PVDF膜：理論上只有疏水性低的單克隆抗體（PVDF膜疏水性）才需要乙醇預潤濕，部分疏水性抗體無需該步驟。預潤濕可能會導致嚴重的膜泄露，以及增加額外的實驗步驟，因此針對部分抗體建議測試乙醇預潤濕對分析結(jié)果性能的影響。
（7）每孔細胞數(shù)：如果抗原特異性T細胞頻率未知，推薦以3-5×105細胞/孔作為起始數(shù)目。在1-8×105細胞/孔的范圍內(nèi)，加入的細胞數(shù)與形成的斑點數(shù)具有良好的線性關(guān)系，實際可根據(jù)需求進行調(diào)整。此外，由于臨床樣本的珍貴性，PBMC以105細胞/孔設(shè)置多個復孔，可以幫助獲得較準確的結(jié)果。
注：如有必要，可通過滴定來確定ELISPOT實驗所使用的細胞密度，以獲得特定組織類型來源細胞的最佳斑點分離效果。文獻[1]給出了一些常見細胞的推薦使用濃度。在使用純化的T淋巴細胞或者每孔細胞數(shù)少于106時，推薦在活化期間加入額外的飼養(yǎng)層細胞（比如脾細胞）或抗原提呈細胞（APC），前提是確保加入這些細胞有效。特定組織每孔細胞常用濃度為：
①小鼠引流淋巴結(jié)細胞：0.5×106細胞/孔③小鼠腦來源的單核細胞（在實驗性自身免疫性腦脊髓炎中，EAE研究）：2-5×104細胞/孔⑥小鼠APCs：脾細胞或胸腺細胞：0.5×106細胞/孔；B細胞：4×104細胞/孔
⑨人APCs：自體PBMCs 0.5×106細胞/孔
（8）添加APC：PBMC中含有豐富的能夠刺激T細胞的APC。巨噬細胞、B細胞以及DC細胞具有類似的刺激作用。雖然DC細胞的活化速度更快，單個細胞產(chǎn)生的細胞因子量更多，但是這些差異在培養(yǎng)24 h后基本消失。因此，對于常規(guī)的ELISPOT分析，額外添加DC細胞作為APC對檢測結(jié)果的影響可能不大，但卻大大增加了實驗操作的復雜性。因此建議對額外添加DC細胞的效果進行驗證，減少后續(xù)不必要的操作。
（9）DMSO濃度控制：大多數(shù)I類MHC限制性肽是疏水性的，需要用DMSO助溶，超過0.5%濃度的DMSO對淋巴細胞，尤其是活化的淋巴細胞有毒。
