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Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒使用方法
最近更新時(shí)間：2016-3-24
提 供 商：北京諾博萊德科技有限公司資料大?。?/span>7.5KB
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組成 | 包裝（2500微孔) | 保存 |
5×G250染色液 | 100ml | 2-8℃ |
PBS稀釋液 | 30ml | 2-8℃ |
蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5mg/ml BSA) | 1ml | -20℃ |
本試劑盒自訂購(gòu)之日起九個(gè)月內(nèi)有效。本試劑盒用于酶標(biāo)板或者200ul比色皿時(shí)可做2500孔。當(dāng)使用2ml比色皿時(shí)可做250孔，如果是1ml比色皿時(shí)可做500孔。
考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的zui大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?/span>595nm，在一定的濃度范圍內(nèi)，測(cè)定的吸光度值A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。Bradford法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。樣品中巰基乙醇的濃度可高達(dá)1M，二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá)5mM。但受略高濃度的去垢劑影響。需確保SDS低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween 20, 60, 80低于0.06%。含去垢劑的樣品推薦使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。
操作說(shuō)明：
1. *溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10ml，加240ulPBS稀釋至250ml ，使終濃度為0.2mg/ml。待測(cè)蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
2. 5×G250染色液使用前請(qǐng)顛倒3-5次混勻，取1ml 5×G250染色液，加入4ml雙蒸水，混勻成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。
3. 將標(biāo)準(zhǔn)品按0, 2,4,6,8,12,16,20微升分別加到96孔板中，加PBS稀釋液補(bǔ)足到20微升。
4. 將樣品作適當(dāng)稀釋（多做幾個(gè)梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋），加20微升到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量時(shí)的誤差，標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線1/2后。
5. 各孔加入200微升稀釋后的1×G250染色液，室溫放置3-5分鐘。
6. 用酶標(biāo)儀測(cè)定A595，或560-610nm之間的其它波長(zhǎng)的吸光度。
7. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。
如沒(méi)有酶標(biāo)儀，可用分光光度計(jì)在離心管中混勻后加入比色皿中比色。
步驟如下：
1，取八支（或者更多）干凈的10ml離心管，標(biāo)記上號(hào)。
2，取100ulBSA，加PBS2.4ml稀釋至終濃度為0.2mg/ml。
3，5×G250染色液使用前請(qǐng)顛倒3-5次混勻，取10ml 5×G250染色液，加入40ml雙蒸水，混勻成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。
4，按下表加入試劑(以每孔5ml計(jì)，多余的用來(lái)潤(rùn)洗比色皿)
離心管號(hào) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7（樣品管1） | 8（樣品管2） | 9（樣品管3） |
標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA | 0 | 100ul | 200ul | 300ul | 400ul | 500ul | 500ul適當(dāng)稀釋的樣品1 | 500ul適當(dāng)稀釋的樣品2 | …… |
PBS | 500ul | 400ul | 300ul | 200ul | 100ul | 0 | 0 | 0 | 0 |
1×G250染色液 | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml |
5，反應(yīng)3分鐘后測(cè)OD值。為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，可每間隔2分鐘加一管染色液，每間隔2分鐘測(cè)一管OD值。如下表。
離心管號(hào) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | …… |
加染色液（分鐘） | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 | …… |
測(cè)OD值 | 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 13 | 15 | 17 | …… |