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使用在線固相萃取和柱間衍生直接分析血漿中的雌性激素
PromoChrom Technologies Ltd.
雌激素是一類(lèi)甾體化合, 主要有雌酮 （estrone, E1）, 雌二醇 （estradiol, E2）,
和雌三醇 （estriol, E3）等。雌激素的分析對(duì)于疾病的診斷具有重要的意義。
雌激素的分析通常是使用 HPLC 或 LC-MS。由于檢測(cè)的濃度比較低, 而紫外和質(zhì)譜
檢測(cè)器對(duì)這類(lèi)化合物的靈敏度又不是很理想, 在分析前通常需要衍生化。衍生化通
常是在手動(dòng)的條件下進(jìn)行。反應(yīng)的加熱時(shí)間, 放置時(shí)間, 和試劑用量的差異都會(huì)影
響分析結(jié)果的重復(fù)性. 此外, 衍生化試劑是直接加入到未經(jīng)凈化的樣品中, 樣品成
分的變化也會(huì)影響衍生反應(yīng)的進(jìn)行。
本文以雌酮為例, 介紹一種血漿中雌性激素的直接分析方法。樣品經(jīng)在線全自動(dòng)固相萃取儀
凈化和在線衍生后直接用 HPLC分析, 樣品制備和儀器分析全部自動(dòng)完成。
材料和方法
儀器
儀器包括一臺(tái) SPE-04 多功能樣品制備儀和安捷倫 1100 液相色譜儀 （含四元泵和紫外檢測(cè)
器）。兩套儀器通過(guò)遙控信號(hào)實(shí)現(xiàn)同步。
方法
下面兩張圖描述 SPE-04 的自動(dòng)運(yùn)行步驟和有關(guān)的衍生化反應(yīng):
所用固相萃柱為 PromSil C18, 規(guī)格為 500-mg/3-mL. SPE-04可以使用普通的固相萃
柱, 不需要使用特別的接頭或蓋子。
HPLC條件: 色譜柱, PCTsil-C18 （4.6X250毫米）; 流速, 1.2毫升/分鐘; 淋洗梯度, A為
乙氰, B為 0.1%三氟醋酸, 開(kāi)始為 30%A, 8分鐘內(nèi) A增加到 90%,維持 4分鐘后 A又
降回潮 0%; 檢測(cè)波長(zhǎng), 360納米; 進(jìn)樣體積, 20微升。 雌酮衍生物在此條件下的保留
時(shí)間為 12.0分鐘。
結(jié)果
1. 靈敏度
血漿樣品分別添加 2和 20PPM 雌酮, 用水稀釋一倍,然后用上述方法分析。由下圖
可見(jiàn), 所用的在線 SPE凈化可以有效去除樣品的干擾。衍生后可以使用較長(zhǎng)的檢測(cè)
波長(zhǎng), 也有助于降低基線噪音。根據(jù)下圖估算, 雌酮在血漿樣品中的zui低檢測(cè)濃度在
0.5PPM 以下。要進(jìn)一步提高靈敏度, 可以使用熒光或質(zhì)譜檢測(cè)器。
2. 重現(xiàn)性
水中添加 20 ppm雌酮后重復(fù)分析四次。所得結(jié)果見(jiàn)下表:
雖然雌酮的分析涉及較多的樣品處理步驟, 還是獲得了很好的重現(xiàn)性。這首先要?dú)w
功于樣品制備的自動(dòng)化。特別是衍生步驟的溫度和時(shí)間的控制, 可以有效消除
各次分析反應(yīng)條件造成的差異。
SPE-04 多功能樣品制備儀
SPE-04 多功能樣品制備儀具有以下四種功能: 1） 離線固相萃取; 2） 在線固相萃
取; 3）在線衍生; 4）HPLC 自動(dòng)進(jìn)樣。
當(dāng)使用在線模式時(shí), 凈化后的組份直接進(jìn)入液相色譜儀, 不需要濃縮和樣品轉(zhuǎn)移等步
驟, 既可以提率和重復(fù)性, 又可以減輕操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。
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