羅氏LightCycler® 480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)是實(shí)驗(yàn)室中常用的一款中高通量qPCR平臺。以下是其標(biāo)準(zhǔn)的使用步驟流程，適用于絕大多數(shù)使用SYBR Green或TaqMan探針進(jìn)行核酸擴(kuò)增和定量分析的場景：

羅氏LightCycler® 480 使用步驟

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1. 核酸提取

• 提取DNA或RNA（如為RNA需進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA）

• 評估濃度與純度（建議A260/A280介于1.8–2.0）

2. 試劑準(zhǔn)備

• 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案選擇合適的qPCR試劑（如SYBR Green I Master、Probe Master）

• 準(zhǔn)備引物/探針工作液，確保無氣泡、低溫避光保存

二、反應(yīng)體系配置

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系（以20 µL體積為例）：

注意：

• 所有反應(yīng)成分應(yīng)在冰上配置；

• 引物濃度通常在0.2–0.5 µM之間；

• 若使用多重qPCR，請確保熒光通道互不干擾。

三、裝板與封板

1. 將反應(yīng)混合液分裝至96孔或384孔反應(yīng)板中；

2. 使用專用光學(xué)封板膜密封反應(yīng)板；

3. 輕壓封膜并離心去除氣泡（例如2000 rpm × 30秒）；

4. 插入LightCycler® 480中指定托架位置。

四、程序設(shè)定（軟件操作）

在LightCycler® 480 Software中設(shè)置PCR程序，以下為常用的SYBR Green法設(shè)定模板：

1. 預(yù)變性：95°C, 10 min

2. 循環(huán)階段（40–45 cycles）：

• 變性：95°C, 10 sec

• 退火：60°C, 20 sec（具體溫度依引物而定）

• 延伸：72°C, 20 sec（有時(shí)與退火合并）

3. 熔解曲線分析（如用SYBR Green）：

• 95°C, 5 sec

• 65°C–95°C逐步升溫，每步0.5°C，采集熒光

4. 熒光采集通道：根據(jù)染料選擇通道（如FAM通道用于SYBR或FAM-TaqMan探針）

五、運(yùn)行與監(jiān)控

1. 確認(rèn)熱蓋溫度（一般為105°C）；

2. 啟動程序運(yùn)行，期間可實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)增曲線；

3. 運(yùn)行時(shí)間約為1.5–2小時(shí)（視程序設(shè)定而定）；

六、數(shù)據(jù)分析

1. 擴(kuò)增曲線查看：確認(rèn)每孔反應(yīng)特征，是否存在拖尾、背景信號；

2. Ct值判讀：導(dǎo)出或自動生成Ct結(jié)果表；

3. 熔解曲線分析（SYBR Green）：判斷特異性與是否出現(xiàn)非特異擴(kuò)增；

4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法（如絕對定量）：生成曲線并計(jì)算拷貝數(shù)；

5. 表達(dá)量分析（如相對定量）：使用ΔΔCt法比較表達(dá)差異；

七、數(shù)據(jù)導(dǎo)出與保存

• 可導(dǎo)出 .xls, .pdf, .xml 等格式結(jié)果；

• 保存完整項(xiàng)目用于追溯和后續(xù)分析；

• 建議同時(shí)備份至本地和實(shí)驗(yàn)室服務(wù)器。

八、儀器清潔與維護(hù)

• 每次使用后清理反應(yīng)板托盤；

• 定期進(jìn)行光路校準(zhǔn)與溫控驗(yàn)證；

• 每月檢查熱蓋壓力與熒光通道響應(yīng)；

• 若長期不使用，建議進(jìn)行關(guān)機(jī)保護(hù)處理。