賽默飛ABI 7500實時熒光定量PCR儀技術(shù)介紹

一、設(shè)備概述

ABI 7500實時熒光定量PCR儀是Thermo Fisher Scientific旗下Applied Biosystems系列的一款用于核酸定量分析的實驗設(shè)備。該系統(tǒng)集成了高精度溫控模塊、熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)與分析軟件，可用于多種分子生物學(xué)實驗中的DNA、RNA擴(kuò)增與定量分析，適用于科研、臨床輔助檢測及教學(xué)實驗等場景。

本儀器采用基于TaqMan探針和SYBR Green等熒光染料的實時檢測技術(shù)，在反應(yīng)過程中實時監(jiān)測熒光信號變化，以推算擴(kuò)增產(chǎn)物的起始拷貝數(shù)，從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因的絕對或相對定量。

二、主要技術(shù)參數(shù)

1. 反應(yīng)孔數(shù)與反應(yīng)體系

• 配備標(biāo)準(zhǔn)96孔反應(yīng)模塊，適配標(biāo)準(zhǔn)0.2 mL PCR管或板；

• 反應(yīng)體系體積范圍：10–100 μL。

2. 溫控系統(tǒng)

• 采用Peltier元件控溫，升降溫速率可達(dá)1.6°C/s；

• 溫控精度：±0.25°C；

• 均一性（Uniformity）：<0.5°C（在90分鐘PCR程序末端）；

• 設(shè)定溫度范圍：4°C至100°C；

• 熱蓋功能可調(diào)，防止樣品蒸發(fā)。

3. 光學(xué)檢測系統(tǒng)

• 配備高強(qiáng)度氙燈（Xenon Lamp）作為激發(fā)光源；

• 五通道檢測，支持多重?zé)晒鈽?biāo)記（FAM、VIC、ROX、SYBR、TAMRA等）；

• 熒光檢測采用多通道濾光片系統(tǒng)，實時采集反應(yīng)曲線；

• 數(shù)據(jù)采集精度高，可實現(xiàn)單拷貝檢測。

4. 軟件系統(tǒng)

• 使用SDS軟件（System Detection Software）進(jìn)行實驗設(shè)置與結(jié)果分析；

• 支持Ct值分析、標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建、絕對/相對定量分析、基因表達(dá)分析、SNP分型、熔解曲線分析等功能；

• 數(shù)據(jù)格式兼容性好，可導(dǎo)出為Excel、CSV等格式，便于進(jìn)一步統(tǒng)計分析；

• 支持圖形可視化、模板管理和自動報告生成。

三、系統(tǒng)組成與工作原理

1. 組成結(jié)構(gòu)

• 主機(jī)：包含溫控模塊、熒光激發(fā)與檢測系統(tǒng)、自動熱蓋；

• 控制終端：PC端軟件連接主機(jī)進(jìn)行控制與數(shù)據(jù)分析；

• 電源與通信接口：支持USB連接和LAN網(wǎng)絡(luò)；

• 軟件套件：含標(biāo)準(zhǔn)實驗?zāi)０濉?shù)據(jù)管理模塊、統(tǒng)計分析工具。

2. 工作流程

• 準(zhǔn)備反應(yīng)體系（包括引物、探針、模板、反應(yīng)緩沖液）；

• 裝載PCR反應(yīng)板至儀器；

• 設(shè)置PCR程序及熒光采集參數(shù)；

• 系統(tǒng)按預(yù)設(shè)程序升溫、擴(kuò)增并采集熒光信號；

• 通過軟件進(jìn)行結(jié)果分析，如Ct值計算、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等。

3. 檢測機(jī)制

• 熒光信號由特定波長激發(fā)并由對應(yīng)波長濾光片檢測；

• 每個循環(huán)結(jié)束時采集熒光強(qiáng)度，生成擴(kuò)增曲線；

• 熒光信號與擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量成正比；

• 使用參考染料（如ROX）進(jìn)行信號校正，確保結(jié)果穩(wěn)定。

四、實驗應(yīng)用舉例

1. 基因表達(dá)定量分析

• 常用于mRNA水平的相對表達(dá)分析；

• 通過ΔΔCt法評估處理組與對照組間的表達(dá)變化；

• 可用于細(xì)胞應(yīng)答研究、基因功能驗證、藥物作用機(jī)制研究。

2. 基因分型與突變檢測

• 利用SNP探針進(jìn)行個體基因型判別；

• 可識別單堿基突變、插入缺失等小范圍變異；

• 適用于遺傳疾病研究與個體化醫(yī)學(xué)篩查。

3. 病毒載量檢測

• 對病毒RNA/DNA進(jìn)行絕對定量，評估感染程度；

• 應(yīng)用于HIV、HBV、SARS-CoV-2等臨床監(jiān)測；

• 支持通過外標(biāo)曲線精確測算目標(biāo)序列拷貝數(shù)。

4. 轉(zhuǎn)基因成分檢測

• 檢測GMO農(nóng)產(chǎn)品中外源基因存在與含量；

• 可用于農(nóng)業(yè)監(jiān)管、食品安全與貿(mào)易合規(guī)。

5. 微生物檢測與菌群分析

• 快速檢測特定微生物；

• 可進(jìn)行定性篩查或定量評價；

• 支持16S rRNA等目標(biāo)序列分析。

五、設(shè)備操作要點與維護(hù)建議

1. 操作規(guī)范

• 嚴(yán)格控制反應(yīng)體積、試劑濃度及移液準(zhǔn)確性；

• 每次實驗前需校準(zhǔn)熱蓋與熒光檢測系統(tǒng)；

• 保持儀器通風(fēng)良好、無灰塵污染。

2. 維護(hù)要點

• 定期更換光源燈泡并校準(zhǔn)光路；

• 檢查并清潔濾光片及熱蓋；

• 軟件需定期更新，避免兼容性問題；

• 長期不使用時建議拔除電源，并進(jìn)行防潮處理。

六、技術(shù)優(yōu)勢與注意事項

1. 優(yōu)勢特點

• 操作流程標(biāo)準(zhǔn)化，適合多用戶共享平臺；

• 軟件界面清晰，易于設(shè)置與分析；

• 檢測靈敏度高，適合低拷貝序列定量；

• 支持多重?zé)晒鈾z測，節(jié)省時間與樣本量。

2. 常見問題及規(guī)避

• 空白孔熒光異常：檢查污染或反應(yīng)體系配置錯誤；

• 熔解曲線異常：排查引物二聚體、污染擴(kuò)增等；

• 弱陽性/擴(kuò)增失敗：優(yōu)化引物、退火溫度或酶系統(tǒng)。

七、總結(jié)與適用性評估

ABI 7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)憑借其穩(wěn)定的控溫性能、靈敏的熒光檢測能力及功能完善的軟件平臺，在多種分子生物實驗中具有廣泛適用性。其標(biāo)準(zhǔn)化配置與模塊化功能可滿足實驗室對數(shù)據(jù)可重復(fù)性與檢測精度的要求。作為一款成熟的實時定量PCR平臺，該設(shè)備尤其適合需要中等通量、標(biāo)準(zhǔn)分析功能的科研單位、醫(yī)學(xué)檢驗機(jī)構(gòu)和高校教學(xué)實驗室。