細(xì)胞SGK1激酶活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  細(xì)胞SGK1激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物，在敏感性抑制劑存在與否的情況下，受到SGK1磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測定其氧化后峰值的變化，以分析細(xì)胞裂解樣品中SGK1活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或純化酶樣品中SGK1激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶（Serum-glucocorticoid regulated kinase；SGK），是血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性蛋白激酶家族成員，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase；EC2.7.11.1）家屬。其功能在于調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路、細(xì)胞繁殖和存活、應(yīng)激反應(yīng)、離子（鈉、鉀和鈣）轉(zhuǎn)運、腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、自噬等。SGK有3種亞體：SGK1、SGK2和SGK3。其中SGK1在所有組織中表達，分布在細(xì)胞質(zhì)中，屬于AGC亞型家族，結(jié)構(gòu)和功能上與AKT類似。SGK1由3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）體外激活，并在體內(nèi)對于磷脂酰肌醇3-激酶活化產(chǎn)生的信號作出應(yīng)答。通過使FKHRL1磷酸化和失活，促使細(xì)胞生存。血清和地塞米松刺激增加SGK1的mRNA表達水平。SGK1和SGK3在PKB/AKT非依賴性磷酸肌醇3-激酶調(diào)理的腫瘤生成中發(fā)揮作用，肺癌和前列腺癌的SGK1水平增高，而乳腺癌的SGK3水平增高，由此成為腫瘤治療的藥物靶標(biāo)，以及預(yù)后指標(biāo)。SGK1與高血壓、糖尿病、炎癥、自身免疫疾病、血管生成、生命長度等相關(guān)。其磷酸化目標(biāo)序列為RPRAATF。基于底物RPRAATF，在ATP的參與下，同時在SGK1敏感的抑制劑EMD638683存在與否的情況下，受到SGK1激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析SGK1激酶的特異活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）         毫升

  裂解液（Reagent B）         毫升

  緩沖液（Reagent C）          毫升

  酶促液（Reagent D）          毫升

  反應(yīng)液（Reagent E）         毫升

  底物液（Reagent F）        毫升

  陰性液（Reagent G）         微升

  專性液（Reagent H）         微升

產(chǎn)品說明書              1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

SGK1激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細(xì)胞預(yù)處理

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實驗步驟

一、 待測樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升  清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx至xx微升  裂解液（Reagent B），充分混勻（注意：可以調(diào)節(jié)蛋白濃度）

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取100至500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

3．   緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升  酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入xx微升  陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘 

四、 樣品總活性測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升  酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入10微升待測樣品（注意：100微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘 

五、 樣品非特異活性測定

檢測開始前，移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升  專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：100微克細(xì)胞裂解蛋白），混勻后，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升  酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升  底物液（Reagent F） 

5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入40微升上述預(yù)處理的待測樣品

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

六、 計算樣品活性

1） 樣品總活性和非特異活性計算

2）樣品特異活性計算

六、酶標(biāo)儀測定

1）樣品總活性測定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 分別加入xx微升  酶促液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent E）

5． 分別加入xx微升  底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動96孔板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入xx微升  陰性液（Reagent G）或待測樣品（100微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動96孔板

10． 即刻放進酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

11． 活性計算：

2） 樣品非特異活性測定

檢測開始前，移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升  專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：100微克細(xì)胞裂解蛋白），混勻后，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品

2． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 加入xx微升  酶促液（Reagent D）

4． 加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent E）

5． 加入xx微升  底物液（Reagent F） 

6． 輕輕搖動96孔板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 加入40微升上述預(yù)處理的待測樣品

9． 輕輕搖動96孔板

10． 即刻放進酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

11． 活性計算：

3） 樣品特異活性計算

七、抑制劑篩選

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、活性和待測抑制劑樣品

2． 按下表加入試劑，進行樣品預(yù)處理

3． 分別移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里

4． 分別加入xx微升  酶促液（Reagent D）

5． 分別加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent E）

6． 分別加入xx微升  底物液（Reagent F） 

7． 輕輕搖動96孔板

8． 在30℃溫度下孵育3分鐘

9． 加入40微升上述預(yù)處理的待測樣品

10． 即刻放進30℃酶標(biāo)儀檢測：測讀30分鐘

11． 抑制活性計算：

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測定

7． 建議使用比色皿測定

8． 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘

9． 光度測定后，比色皿須清洗

10． 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

11． 樣本測定讀數(shù)持續(xù)上升，表明酶活過低或樣品量過低

12． 非特異活性高于總活性，表明特異性酶活過低或樣品量過低

13． 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/10微升（本公司提供    Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

14． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

15． SGK1激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

16． 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感