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隨著生物組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，細(xì)胞培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)已不再局限于簡(jiǎn)單的工藝參數(shù)優(yōu)化，而是深入探索系統(tǒng)的組學(xué)研究。這樣的轉(zhuǎn)變旨在更好地滿足生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展需求。為此，細(xì)胞培養(yǎng)需要朝著大規(guī)模、自動(dòng)化、低成本以及高目的產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量的方向發(fā)展。在這一發(fā)展過(guò)程中，準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)生物過(guò)程中的實(shí)際需求至關(guān)重要，尤其是確定最關(guān)鍵的質(zhì)量參數(shù)。

抗體藥物是通過(guò)培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞來(lái)制造的。開(kāi)發(fā)這些宿主細(xì)胞是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域，大阪大學(xué)的Omasa實(shí)驗(yàn)室最近建立了源自中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞（CHL-YN細(xì)胞）的細(xì)胞系。與常用于抗體生產(chǎn)的CHO-K1細(xì)胞相比，CHL-YN細(xì)胞的生長(zhǎng)速度約為2倍。

了解宿主細(xì)胞的代謝對(duì)于實(shí)現(xiàn)這些細(xì)胞在工業(yè)上的應(yīng)用非常重要，但對(duì)于CHL-YN細(xì)胞的代謝尚未進(jìn)行充分研究。最近的研究報(bào)告了培養(yǎng)基中有機(jī)/無(wú)機(jī)組分變化對(duì)抗體生產(chǎn)和質(zhì)量的影響。因此，培養(yǎng)基的分析必須包括有機(jī)和無(wú)機(jī)組分，以便能夠了解宿主細(xì)胞的代謝過(guò)程。這將有助于優(yōu)化抗體生產(chǎn)過(guò)程，提高抗體質(zhì)量，進(jìn)而推動(dòng)抗體藥物的研發(fā)與應(yīng)用。

本應(yīng)用報(bào)告使用LCMS-8060NX分析 140多種有機(jī)化合物，并使用 ICPMS-2030分析 CHL-YN 抗體產(chǎn)生細(xì)胞系培養(yǎng)物的培養(yǎng)基和培養(yǎng)上清液中的 9 種無(wú)機(jī)元素。通過(guò)這些數(shù)據(jù)，研究人員得以確定參與抗體生產(chǎn)的成分和代謝途徑。

樣品：

CHL-YN細(xì)胞在指定條件下培養(yǎng)，每24小時(shí)收集培養(yǎng)上清液（生物學(xué)重復(fù)n = 3）。

樣品前處理方法：

圖1 LC-MS/MS樣品前處理方法

圖2  ICP-MS樣品前處理方法

分析條件：略。

分析結(jié)果：

LC-MS/MS部分：

結(jié)合LC/MS/MS細(xì)胞培養(yǎng)分析方法包檢測(cè)到74種組分的數(shù)據(jù)，再通過(guò)多組學(xué)分析包進(jìn)行可視化分析。74種有機(jī)組分隨時(shí)間變化過(guò)程如圖3所示。

圖3  74種有機(jī)組分隨時(shí)間變化過(guò)程分析結(jié)果

其中，表現(xiàn)出明顯變化的組分如圖4和圖5所示。圖4中顯示，有機(jī)組分在細(xì)胞培養(yǎng)的后期耗盡，提供了有助于研究培養(yǎng)條件的信息。圖5中顯示，隨著時(shí)間的推移，有機(jī)組分在消耗和分泌之間切換。這是一個(gè)有價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，表明新陳代謝發(fā)生了變化。

圖4 細(xì)胞培養(yǎng)后期耗盡的有機(jī)組分

圖5  隨著時(shí)間的推移在消耗和分泌之間切換的有機(jī)組分

面積比（縱軸）：被測(cè)組分的峰面積除以內(nèi)標(biāo)峰面積。

每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表n = 3個(gè)生物重復(fù)的平均值;陰影區(qū)域表示誤差范圍

ICP-MS部分：

使用ICPMS-2030分析培養(yǎng)基上清液中的金屬元素，主要集中在據(jù)報(bào)道影響抗體產(chǎn)生的元素上：鈷、銅、鐵、鎂、錳、鉬、鎳、硒和鋅。

圖6  ICP-MS測(cè)定培養(yǎng)上清液中金屬組分隨時(shí)間變化的過(guò)程

每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表n = 3個(gè)生物重復(fù)的平均值;陰影區(qū)域表示誤差范圍。

數(shù)據(jù)分析：

利用得到的數(shù)據(jù)可以開(kāi)展進(jìn)一步代謝組學(xué)分析，如相關(guān)分析和富集分析。

通過(guò)以特異性抗體產(chǎn)生速率（單位時(shí)間內(nèi)單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的抗體量）為目標(biāo)變量，以有機(jī)和無(wú)機(jī)組分的測(cè)定值為解釋變量進(jìn)行相關(guān)性分析，確定抗體產(chǎn)生中涉及的組分和代謝途徑。

絕對(duì)相關(guān)系數(shù)大于0.5且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）小于0.05的組分被確定為與特異性抗體產(chǎn)生率相關(guān)。

通過(guò)相關(guān)分析確定了符合這些標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)和無(wú)機(jī)組分。上表顯示了與特異性抗體產(chǎn)生率呈正相關(guān)的一些組分（相關(guān)系數(shù)>0.5和FDR<0.05）。

總結(jié)：

1.通過(guò)簡(jiǎn)單的樣品前處理，對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)上清液中的有機(jī)組分和無(wú)機(jī)組分進(jìn)行同時(shí)分析，并提供每種組分隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)。

2.發(fā)現(xiàn)了耗盡或表明代謝轉(zhuǎn)變的組分。

3.以特異性抗體產(chǎn)生速率為目標(biāo)變量進(jìn)行的相關(guān)分析確定了與抗體產(chǎn)生相關(guān)的成分以及與抗體產(chǎn)生相關(guān)的代謝途徑。

4.使用島津LC-MS/MS和ICP-MS分析細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的組分獲得的數(shù)據(jù)，可以鑒定抗體生產(chǎn)中涉及的化合物和代謝途徑。

[致謝]

本應(yīng)用報(bào)告是島津與大阪大學(xué)研究生院Omasa實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合研究計(jì)劃的一部分。感謝參與這項(xiàng)研究計(jì)劃的每一位研究者的幫助。

參考文獻(xiàn)：

1，an-01-00498, Shimadzu Application News, Culture Medium Analysis for a Metabolic Analysis of Antibody-Producing Cells Using LC-MS/MS and ICP-MS

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