對于養(yǎng)細胞的人來說

可謂是談“污”色變

每次養(yǎng)細胞總讓人精神錯亂

打開培養(yǎng)皿的那一刻

連呼吸都是如此多余

只要有任何的異樣

無論是支原體還是雜菌

污染/污染/污染

猶如細胞實驗的魔宙

讓一切都無限重復(fù)

那么如何將失敗率降到更低，讓我們擺脫玄學的定律呢？

今天專門為大家盤點了細胞培養(yǎng)超實用干貨

細菌污染最為常見，一旦操作稍有不當，就會引起細胞污染，細菌污染后顯微鏡下觀察呈現(xiàn)有黑色細條沙狀，當然，根據(jù)感染的細菌不同，所呈現(xiàn)的狀態(tài)也不盡相同，有球形、桿狀等，其次，培養(yǎng)液發(fā)黃，變渾濁，可明顯看見培養(yǎng)皿中有細沙狀的沉淀物，時不時還有異樣氣味發(fā)出，如下圖所示：

處理方法：

　　在培養(yǎng)基中加入抗生素處理，可以用四環(huán)素，慶大霉素，或者鏈霉素，前兩者的工作濃度是50 μg/mL;鏈霉素的工作濃度是100 μg/mL。但是，細胞本身也有影響，狀態(tài)大不如從前，所以，防范于未然，正確操作、嚴格執(zhí)行無菌操作規(guī)范，定期清理消毒培養(yǎng)設(shè)施才是關(guān)鍵!
二、真菌污染

　　真菌污染培養(yǎng)液清亮透明，不會像細菌感染大爆發(fā)，所以很難早期發(fā)現(xiàn)，鏡下有時候象絲狀，有時候象珊瑚狀，慢慢地會長出很細的黑色絲狀物，這個時候，已經(jīng)晚了，細胞很難救活了。

處理方法：趕緊扔掉，不要再想挽救，即使再珍貴。然后*消毒滅菌培養(yǎng)間，CO2孵箱，器皿和培養(yǎng)液。

三、霉菌污染

　　同真菌感染一致，因為培養(yǎng)液是清亮的，所以霉菌污染早期難以發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)為時過晚了。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，如同風中柳絮，一般不仔細看發(fā)覺不出來。細胞仍可生長，但時間一長，細胞的狀態(tài)就變差，不再增長。見下圖。

　　處理方法：建議果斷舍棄該污染細胞，將環(huán)境*消毒，因為霉菌的頑固可能會導(dǎo)致下幾批細胞都會污染，所以，采用酒精*底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新潔爾滅擦洗一遍，把水盤里加上飽和量的硫酸銅。千萬不可大意

四、支原體感染

　　培養(yǎng)液變渾濁，支原體感染細胞以后，細胞病變不很明顯，只是細胞狀態(tài)變差、生長變慢，在顯微鏡下觀察可能會有小黑點，但培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁。細胞傳代以后就出現(xiàn)細胞間黑點，細胞空泡化，很多類似凋亡、壞死的細胞，最終細胞漂浮，*死亡。

處理方法：

　　如果不是很珍貴的細胞的話，建議直接扔了吧。

五、黑膠蟲污染

開始污染時對細胞無影響，當數(shù)量達到一定程度時就會對細胞產(chǎn)生影響。400倍顯微鏡下可見點狀或片狀游動小體，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。

　　處理方法：可以增加細胞的種板密度，以提高細胞的生存率，盡早處理細胞，越快越好。

根據(jù)細胞生長特性的不同，傳代可分為懸浮細胞傳代和貼壁細胞傳代兩種類型，對于懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進行傳代，或用離心法后，加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進行傳代；貼壁生長的細胞則用消化法進行傳代，下面我們介紹傳代培養(yǎng)的一些注意事項；

一、貼壁細胞傳代如何使用胰酶？

一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。

消化液濃度過高時，易造成培養(yǎng)基中細胞碎片增多，黑渣子增多，常規(guī)細胞傳代時建議用0.05%的胰酶進行消化，對于難消化的細胞可采用0.25%胰酶進行消化，細胞密度過高超過80%時，采用分步消化法。胰酶儲存在–20°C，解凍在4°C進行，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。

二、如何控制胰酶消化時間？

胰酶消化的程度是細胞培養(yǎng)中的一個關(guān)鍵步驟：消化過度細胞碎片增多，黑渣子增多，細胞會成片脫落，嚴重影響細胞活性，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會損傷細胞活性。

不同細胞對消化液的敏感性不同，胰酶消化的時間也會有差異。胰酶消化時間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲存時間，胰酶的儲存溫度，是否反復(fù)凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細胞的密度有關(guān)。消化對于新購買的細胞，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細去摸索一下消化時間，可每隔1分鐘鏡下觀察細胞是否變圓，記錄最佳消化時間，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。

三、細胞抱團怎么處理？

一些懸浮細胞抱團生長是正?，F(xiàn)象，大部分懸浮細胞在細胞密度很高的情況下，很可能會出現(xiàn)部分細胞抱團生長的現(xiàn)象，聚團細胞很容易死亡并演化成絮狀物，殃及周圍的懸浮細胞，因此在培養(yǎng)懸浮細胞時需控制好細胞密度。如果出現(xiàn)了細胞團，可以通過細胞篩去掉部分較大的細胞團，也可以嘗試一下方法：將細胞懸液收集到15 ml離心管中，靜置20 min左右，小心取上層細胞上清培養(yǎng)（該方法只能去除部分較大的細胞團）。

四、細胞內(nèi)有空泡，是否是正?，F(xiàn)象？

部分細胞本身存在一定的空泡（如HepG2，Ishikawa及一些耐藥株等），這個是正?，F(xiàn)象。如果只有少數(shù)細胞有內(nèi)出現(xiàn)極少空泡，則很可能是細胞狀態(tài)不佳，可以通過調(diào)整血清濃度，控制消化，控制傳代比例及時間等方法來調(diào)整細胞狀態(tài)；如果大部分細胞出現(xiàn)空泡，且單個細胞內(nèi)空泡數(shù)目偏多，則可能細胞代次較高，細胞老化所致，需更換代次較早的細胞。

五、細胞生長逐漸變慢是什么原因？

細胞增殖變慢有以下原因：1. 消化過度 2. 傳代過密 3.細胞營養(yǎng)不良 4.細胞頻繁傳代 5.細胞狀態(tài)不佳或老化 6.細胞存在污染。

六、細胞何時進行傳代較好？

一般情況下細胞生長至*匯合后就應(yīng)該傳代，所有細胞生長都有一個要求不宜生長過密（也就是常說的長老了），但有接觸抑制的細胞，在匯合前就必須進行傳代，這類細胞一般在密度70-80%就進行傳代，否則會引起細胞分化。

一、復(fù)蘇

1）取出凍存管，立即放入37度水浴箱中快速解凍（1分鐘左右），水面不可沒過蓋子，以避免污染。

2）將凍存管移至無菌操作內(nèi)。打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中，1000rpm, 5min，棄上清。

3）加入適量*培養(yǎng)基，置于37度恒溫箱中培養(yǎng)即可。

4）次日更換一次培養(yǎng)液,以去除任何殘留的冷凍保護劑，繼續(xù)培養(yǎng)。

二、凍存

1）用無菌吸管吸棄瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)基；

2）加入少量 PBS 沖洗二遍， 用胰蛋白酶把單層細胞消化下來，依據(jù)傳代的方法把細胞 懸液收集于離心管中，離心 1000 rpm，5-8 min； 

3）小心棄上清液，加入配置好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，然后將含有 細胞的凍存液轉(zhuǎn)移到無菌的凍存管中，每個凍存管加液 1-1.5 ml，細胞最終密度為 （5—10）×106 /ml； 

4）凍存管封口，做好標記，按照以下程序凍存：

第一種方法：標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/min；當溫度達到-25℃以下時，可增至-5℃~-10℃/min；到-150℃時，則可迅速浸入液氮中。

第二種方法：凍存管放入4℃，約30 min,﹣20℃ 30min- 60 min，見細胞懸液結(jié)凍后，放入﹣80 ℃冰箱， 過夜后轉(zhuǎn)入于液氮罐中。 

第三種方法：將凍存管放于程序降溫盒中，并置于-80℃冰箱4h以上，轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。