氣相色譜法快速測定疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸的含量

疏血通注射液是由水蛭和地龍制成的一種主要應用于急性腦卒中的中藥注射劑，水蛭作為傳統(tǒng)中藥，具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的功效，臨床主治心腦血管疾病，包括急性心肌梗死、冠心病心絞痛、高血壓、腦出血、腦梗死等。

化學成分包括多肽、氨基酸、糖脂、碟啶、甾體及羧酸酯等化合物。地龍性寒、味咸，具有痛經(jīng)活絡、平肝息風、清熱止驚的功效，研究報道地龍具有抗炎鎮(zhèn)痛、降脂、抑制血小板聚集等作用，化學成分主要包括蛋白質、多肽、氨基酸、有機酸類、核苷等化合物。

短鏈脂肪酸（SCFAs）主要由腸道微生物代謝碳水化合物及蛋白質形成，分為直鏈型[甲酸（FA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）、戊酸（VA）、己酸（HA）]與支鏈型[異丁酸（i-BA）、異戊酸（i-VA）]。

研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸與高血壓、高血脂、高血糖以及動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切。乙酸、丙酸、丁酸占人體中短鏈脂肪酸的95%以上，其具有明顯的活性，發(fā)揮重要的生理作用。

乙酸可通過短鏈脂肪酸受體FFAR2影響胰島素的分泌，丙酸具有抗炎、降脂、降低血糖的生理作用，丁酸可預防和抑制結腸癌，具有降血糖，降低膽固醇的作用。

研究發(fā)現(xiàn)疏血通注射液中含有大量的乙酸、丙酸、丁酸，因此有必要對疏血通注射液中的乙酸、丙酸、丁酸進行檢測分析，為更好的控制疏血通注射液的質量提供依據(jù)。

短鏈脂肪酸的分析方法較多，如氣質聯(lián)用法（GC-MS）、液質聯(lián)用法（LC-MS）、毛細管電泳法（CE）等。

由于短鏈脂肪酸無紫外吸收且極易揮發(fā)，采用液相色譜法、毛細管電泳法串聯(lián)紫外檢測器測定時，樣品需進行衍生化處理，操作過程繁瑣、耗時較長，與氣質聯(lián)用法相比，使用氣相色譜法測定疏血通注射液中短鏈脂肪酸更加方便快捷。

采用氣相色譜法直接測定疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸，無需衍生化，方法簡單、快速、準確、專屬性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以準確有效的分析疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸含量。

1、儀器與材料

GC-9280型氣相色譜儀；

DB-FFAP毛細管柱（30.00m×0.25mm×0.25μm；）；

十萬分之一電子天平、

萬分之一電子天平；

超聲波清洗器；

振動攪拌器。

無水乙醇、濃鹽酸，超純水，對照品乙酸、丙酸、丁酸、2-乙基丁酸對照品。

2、方法

2.1 儀器與試劑

取乙酸、丙酸、丁酸對照品適量，精密稱定，分別置于10mL容量瓶中，加75%乙醇溶液定容，得到對照品儲備液，濃度分別為乙酸10.63mg/mL、丙酸3.192mg/mL、丁酸1.739mg/mL；

取2-乙基丁酸（2-eBA）對照品適量，精密稱定，置于100mL容量瓶中，以75%乙醇進行定容，得濃度為628.7μg/mL的內標儲備液，置于4℃冰箱中備用。

分別取各對照品及內標儲備液適量，于10mL容量瓶中，加濃鹽酸100μL，以75%乙醇溶液定容，得到混合對照品溶液，濃度分別為乙酸1063.3μg/mL、丙酸240.0μg/mL、丁酸150.0μg/mL、2-乙基丁酸22.0μg/mL，并采用75%乙醇溶液（含1%鹽酸，2-乙基丁酸22.0μg/mL）1∶1逐級稀釋成一系列不同濃度的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

疏血通注射液樣品0.5mL置于離心管中，加1.5mL1.5%鹽酸乙醇溶液（含內標2-乙基丁酸29.5μg/mL），混勻，作為供試品溶液。水蛭、地龍粉末各0.5g置于10mL容量瓶中，加1%鹽酸乙醇溶液振搖，混勻，作為水蛭、地龍供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：DB-FFAP彈性石英毛細管柱；

升溫程序：初始溫度50℃保持1min，以15℃/min升至120℃后保持6min，以7℃/min升至135℃保持1min，以100℃/min升至230℃后保持3min，進樣口溫度：240℃，

檢測器（FID）溫度：240℃，

進樣體積：3μL，

分流比：10∶1，

載氣：高純氮氣（N2），純度＞99.999%，流速1.0mL/min，尾吹氣：高純氮氣（N2），純度＞99.999%，流速25mL/min，氫氣流速30mL/min，空氣流速400mL/min。

3 結果

3.1 方法學驗證

取“2.1"項下配制的一系列不同濃度的混合對照品溶液，按照“2.3"項下色譜條件進樣分析。記錄色譜峰峰面積，以對照品濃度X（μg/mL）為橫坐標，以各化合物峰面積（AST）與內標物峰面積（AIS）比值為縱坐標，繪制各對照品的標準曲線，計算出標準曲線的回歸方程和相關系數(shù)，以信噪比S/N=3、S/N=10分別測定各化合物的檢測線和定量限。研究結果表明：乙酸、丙酸、丁酸在其線性范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.9999，結果見表1。

按照“2.2"項下方法制備疏血通注射液供試品溶液，進行日內精密度、日間精密度（每日分別制備供試品溶液）、重復性和穩(wěn)定性實驗。

日內精密度RSD均小于2.4%，日間精密度RSD均小于0.66%，重復性實驗表明：疏血通注射液中乙酸含量211.70μg/mL，丙酸含量70.20μg/mL，丁酸含量25.60μg/mL，RSD均小于1.3%；各化合物在室溫條件下8h內穩(wěn)定性良好，RSD均小于2.3%，結果見表1。

在此基礎上，開展疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸含量測定的加樣回收率實驗。取疏血通注射液250μL，加入與樣品中乙酸、丙酸、丁酸量相當?shù)膶φ掌啡芤?00μL（含乙酸106.4μg/mL、丙酸28.73μg/mL、丁酸24.35μg/mL），加入75%乙醇（含2%鹽酸，內標2-乙基丁酸35.20μg/mL）1.25mL，混勻，按照“2.3"項下色譜條件分析，乙酸、丙酸、丁酸平均加樣回收率為96.45%~103.70%，RSD均小于4.2%，結果見表2。

3.2 疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸的含量分析

采用建立的氣相色譜-氫焰離子化檢測器方法分析了疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸，氣相色譜圖見圖1，結果顯示各酸分離良好，空白溶劑對其測定無干擾，原料藥水蛭、地龍樣品中均含有乙酸、丙酸、丁酸。

對36批疏血通注射液進行含量測定，結果如表3所示：

疏血通注射液中乙酸含量為382.2~544.6μg/支，

丙酸含量為90.92~217.5μg/支；

丁酸含量為39.74~64.27μg/支；

乙酸、丙酸、丁酸的總含量為545.8~815.8μg/支。

3種短鏈脂肪酸中乙酸相對含量最高，丙酸次之，丁酸，各酸含量差異較大，3種酸總含量相對穩(wěn)定。

2015年版中國藥典一部附錄水蛭藥材為螞蟥、水蛭和柳葉螞蟥的干燥全體，地龍藥材為參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓和櫛盲環(huán)毛蚓除去內臟的干燥體。

疏血通注射液由水蛭與地龍?zhí)崛?、精制而成，將水蛭、地龍藥材分別置于0.9%氯化鈉溶液中浸漬24h絞碎研磨制成勻漿，勻漿液反復凍融、離心，分取上清液，超濾柱粗濾，濾液熱壓處理得水蛭、地龍?zhí)崛∫?，提取液混勻超濾，除菌，分裝即可。

疏血通注射液在制備過程中未引入含乙酸、丙酸、丁酸的試劑，而水蛭與地龍藥材的氣相分析結果顯示兩種藥材中均含有乙酸、丙酸、丁酸，因此推斷疏血通注射液中的乙酸、丙酸、丁酸源自水蛭和地龍。

綜上所述，本研究建立的疏血通注射液中乙酸，丙酸，丁酸的含量測定方法簡便、快速、靈敏，為更好的控制該注射液的質量提供了依據(jù)，也為中藥注射液的質量控制研究提供了參考。