一、實驗原理
凝膠層析又稱排阻層析、分子篩層析和凝膠過濾。凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體物質，其內(nèi)部具有很細微的多孔網(wǎng)狀結構。凝膠層析的機理是分子篩效應。凝膠顆粒在合適溶劑中浸泡，充分吸液膨脹，然后裝入層析柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程中大分子不能進入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙先流出柱外，而小分子可以進入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結構，流速緩慢，以致后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質按順序分離開。
目前使用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和瓊脂糖與葡聚糖組成的復合凝膠。本實驗用的是葡聚糖凝膠，是由多聚葡萄糖與環(huán)氧化氯丙烷通過交聯(lián)反應制成的有孔顆粒狀凝膠。
根據(jù)凝膠層析的原理，對同一類型化合物，其洗脫特征與組分的相對分子質量有關，流過凝膠柱時，按分子大小順序流出，相對分子質量大者走在前面。通常以對相對分子質量的對數(shù)作圖可得一曲線，稱“選擇曲線”，曲線斜率是凝膠性質的一個重要特征，在一定范圍內(nèi)，曲線愈陡分級愈好。在測定末知物的相對分子質量時，以使用曲線的直線部分為宜。
二、實驗用品
（一）器材
（1）層析柱：1.1×100cm。
（2）核酸蛋白質檢測儀或紫外分光光度計。
（3）自動部分收集器，恒壓瓶，口瓶。
（二）試劑
（1）Sephadex G-75。
（2）5% Ba(AC)2。
（3)洗脫液：0.025mol/L Kcl０.２ｍｏｌ／Ｌ 乙酸溶液。
（4）藍色葡聚糖－２０００（２mｇ／ｍｌ）。
（5）Ｎ－乙酰酪氨乙酯（１～２ｍｇ／ｍｌ）。
（6）標準蛋白質混合液（各２～３mg／ｍｌ，用Kcl－乙酸溶液配制）；包括牛血清白蛋白，雞卵清蛋白，胰凝乳蛋白酶原和結晶牛胰島素，均需層析純。
（三）材料
牛血清白蛋白，雞卵清蛋白，胰凝乳蛋白原A，結晶牛胰島素，以上材料均需層析純。
三、實驗程序
（一）操作方法
1.一般操作方法
（１）凝膠的選擇和處理：凝膠顆粒大小均勻。對于顆粒不均勻的凝膠，可將其懸浮于大體積的水中，讓其自然沉降，在一定時間之后，用傾瀉法除去懸浮的過細顆粒。
將稱好的凝膠干粉傾入過量的洗脫液中，室溫下放置，使之充分溶脹。注意不要過分攪拌，以防顆粒破碎。溶脹時間因凝膠交聯(lián)度不同而異。為了縮短溶脹時間，殺死細菌和霉菌，排除凝膠內(nèi)氣泡，可在沸水浴上加熱。
提供商 |
北京來亨科學儀器有限公司 | 下載次數(shù) |
250次 |
資料大小 |
777.9KB | 資料類型 |
PDF 文件 |
資料圖片 |
-- | 瀏覽次數(shù) |
2087次 |
19
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務