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一、實(shí)驗(yàn)原理

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳是通過蛋白質(zhì)和SDS形成復(fù)合物后，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，不同大小分子遷移率不同，達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。

在蛋白質(zhì)溶液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原，使多肽組分分成單個(gè)亞單位；SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。

在一定條件下，SDS與大多蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4g SDS :1g蛋白質(zhì)。由于SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使各種蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度一樣，約為18Å，而長軸則隨蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量成正比地變化。由于蛋白質(zhì)的遷移率與蛋白質(zhì)的凈電荷量成正比，與蛋白質(zhì)在溶液中的摩爾系數(shù)成反比，而不同的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，并具有相同形狀；因此在一定濃度的凝膠中，由于分子篩效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的函數(shù)。

現(xiàn)在常用的SDS-PAGE系統(tǒng)有好幾種，緩沖液系統(tǒng)有連續(xù)和不連續(xù)之分，凝膠形狀可以是柱狀，也可以是平板狀。本實(shí)驗(yàn)采用的是不連續(xù)垂直板電泳，此系統(tǒng)分辨率高，便于電泳樣品間的相互比較，是目前科研工作中廣泛采用的一個(gè)系統(tǒng)。

二、實(shí)驗(yàn)用品

（一）器材

（1）垂直管電泳槽和玻管。

（2）恒壓恒流電泳儀。

（3）酸度計(jì)

（二）試劑  

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：可采用廠家生產(chǎn)的不同相對分子質(zhì)量范圍的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)試劑盒，也可參考常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子量表，從中選擇3~5種蛋白質(zhì)，按照每種蛋白0.5~1mg/ml溶解液，自己配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合試劑。

（2）凝膠貯液：丙烯酰胺30g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色試劑瓶中，4℃貯存。

（3）10% SDS溶液:稱5gSDS,加重蒸水至50ml，微熱使其溶解，置試劑瓶中，4℃貯存。在低溫下易析出結(jié)晶，用前微熱，使其*溶解。

（4）電極緩沖液：稱Tris6.0g,Gly28g,加10%SDS 10ml,加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。

（5）樣品溶解液：內(nèi)含1%SDS,1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚藍(lán)，0.01mol/LPH6.7Tris.Hcl緩沖液。。

（三）材料

待測的已純化的蛋白質(zhì)樣品。

三、實(shí)驗(yàn)程序

（一）操作方法

 1.凝膠柱的制備

預(yù)先準(zhǔn)備潔凈的玻管兩根，玻璃管的一端插在青霉素或疫苗小瓶的橡皮帽中，使其垂直站立在桌面上或管架中。

將配好的凝膠溶液用細(xì)長頭滴管加到預(yù)先準(zhǔn)備好的玻管中，至離上端1cm處，再用注射器緩緩加水3~5mm高，靜止聚合30min,待凝膠與水層之間出現(xiàn)折射率不同的界面時(shí)，說明凝膠聚合，再放置0.5h，待聚合*。

2. 凝膠板的制作

將混合后的分離膠溶液，用細(xì)長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm.用1ml注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水，用于隔絕空氣，使膠面平整。約30min后，可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線，則表示凝膠*聚合。傾去水封層的蒸餾水，用濾紙條吸去多余的水，但不要碰破膠面。用細(xì)長頭的滴管將混合均勻的濃縮膠加到長、短玻璃板的窄縫內(nèi)距玻璃上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。靜置電泳槽，10min左右上膠即可聚合，再放置10~20min,加入PH８.３的Tris甘氨酸電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5cm,輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。

3、樣品的處理

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量蛋白試劑盒的要求加樣品溶解液，自己配制的標(biāo)準(zhǔn)及末知樣品，按0.5~1mg/ml加樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子，在100℃沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。如處理好的樣品暫時(shí)不用，可放在-20℃冰箱保存較長時(shí)間，使用前在100℃沸水中加熱3min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合 。

4.加樣

加樣的體積要根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為10~15µL，若樣品較稀，加樣體積可達(dá)100µL，但注意樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡，如有氣泡可用注射器針頭挑除。加樣時(shí)，將微量進(jìn)樣器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)盡量接近底部，注意針頭不要碰破凹膠面，輕輕加入樣品。由于樣品溶解液中含有比較比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶解液會(huì)自動(dòng)沉降在凝膠表面形成樣品層 。

5. 電泳

 將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，接通冷卻水，打開電泳儀開關(guān)，開始時(shí)電流為10mA,待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至20~30mA,當(dāng)溴酚藍(lán)染料距硅膠框1cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源及冷卻水。

6. 染色與脫色

電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記，在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。將凝膠板放入大培養(yǎng)皿中，加入染色液染色1~2h，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對遷移率。

7. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

將大培養(yǎng)皿放在一張坐標(biāo)紙上，量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離，按下式計(jì)算相對遷移率mR：

  相對遷移率=蛋白樣品距加樣端遷移距離/溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對遷移率為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子量為縱坐標(biāo)在半對數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)區(qū)線。根據(jù)末知蛋白質(zhì)樣品相對遷移率可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相對分子質(zhì)量。

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