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ASMS2020賽默飛線上預(yù)熱講座集錦第四期：生物大分子表征新技術(shù)

飛飛 賽默飛Orbitrap組學(xué)俱樂部 今天

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疫情并不能停止分析科學(xué)家們技術(shù)交流與分享，6月1-12日，質(zhì)譜界盛會—第68屆美國質(zhì)譜年會，在線上盛大舉行。在此之前，賽默飛舉辦了線上預(yù)熱講座，內(nèi)容涵蓋LC-MS新產(chǎn)品，以及蛋白組學(xué)、生物制藥、代謝組學(xué)等應(yīng)用方向，所有內(nèi)容現(xiàn)在仍可通過注冊進(jìn)行線上觀看。

前三期，與大家分享了新儀器的應(yīng)用，蛋白組學(xué)的新技術(shù)與熱點，這期與大家分享講座中的生物大分子表征新技術(shù)。

多樣化液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)用于完整分子量表征

近年來，隨著非變性質(zhì)譜技術(shù)的日趨成熟，生物大分子完整分子量表征方法的多樣性也隨之增加，如色譜及電泳技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用等方法。

非變性質(zhì)譜進(jìn)行完整分子量分析的主要優(yōu)勢包括：

1色譜高通用性；

2分析速度快且樣品使用量??；

3質(zhì)譜的高分辨性能及出色的峰容量可獲得高質(zhì)量質(zhì)譜圖。

非變性質(zhì)譜已被工業(yè)界快速接受，作為完整水平的質(zhì)量屬性監(jiān)測強(qiáng)有力的分析方法。此外，非變性質(zhì)譜也能夠在表征實驗室與QC實驗室之間建立強(qiáng)大的關(guān)聯(lián)。本講座介紹了完整分子量分析的技術(shù)重點及方法的穩(wěn)健性，包括不同質(zhì)譜平臺間方法轉(zhuǎn)換對數(shù)據(jù)的影響（從Q Exactive plus到Exploris 480）。

賽默飛完整分子量分析平臺包括Vanquish Duo雙三元超高效液相、Exploris 480超高分辨質(zhì)譜、變色龍數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，及Protein Metrics數(shù)據(jù)分析軟件。

圖.賽默飛完整分子量分析平臺（點擊查看大圖）

01

SEC平臺

在線SEC-MS作為簡單且穩(wěn)健的分析平臺，可實現(xiàn)高通量生物大分子聚集體分析。Vanquish Duo液相平臺可以使用兩根色譜柱同時進(jìn)行分析和再平衡，當(dāng)一根色譜柱在分析時，另一根色譜柱在平衡，可以大程度節(jié)約分析時間，提高分析通量。

圖.Vanquish Duo實現(xiàn)高通量分析（點擊查看大圖）

經(jīng)過液相分離得到的每個色譜峰經(jīng)過質(zhì)譜檢測，能夠獲得對應(yīng)的單體及聚體的分子量及糖型信息。同時，orbitrap的超高分辨性能可實現(xiàn)每個糖型的基線分離，在非變性條件下得到更準(zhǔn)確的分子量信息。方法穩(wěn)健性的測試，連續(xù)進(jìn)樣413次，每24次進(jìn)一針參比品，17針參比品的色譜疊加圖顯示保留時間及色譜峰的RSD值在3%以內(nèi)。不同實驗室使用不同批次SEC色譜柱，多次技術(shù)重復(fù)實現(xiàn)結(jié)果顯示，單體及聚體的糖型含量保持一致，具有良好的重現(xiàn)性。

圖.非變性質(zhì)譜平臺的穩(wěn)健性（點擊查看大圖）

02

質(zhì)譜平臺轉(zhuǎn)移

將非變性質(zhì)譜平臺從QE Plus轉(zhuǎn)移至Exploris 480上，并做了方法驗證和對比。Exploris 480，45K分辨率時，可在保證高信噪比的同時實現(xiàn)好的分辨率，能夠分辨相差25Da的兩個糖基化修飾峰，可作為Exploris 480分析完整蛋白時合適的分辨率。上樣量從1ug到10ug遞增，譜圖均有良好的信噪比，且糖型相對含量一致。

圖.Exploris 480分辨率和上樣量參數(shù)優(yōu)化（點擊查看大圖）

QE Plus及Exploris 480的質(zhì)譜數(shù)據(jù)（多樣本且技術(shù)重復(fù)）對比顯示，在完整水平上鑒定的糖型及含量高度一致，證實了方法轉(zhuǎn)移的可行性（如下圖所示）。

圖.QE Plus及Exploris 480數(shù)據(jù)對比（點擊查看大圖）

03

CIEX平臺

通過使用可揮發(fā)性鹽流動相及PH梯度分離，可實現(xiàn)在線CIEX-MS分析，如下圖a所示，對于多種單抗混合樣品，可獲得良好的色譜分離及高質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)（可分辨相差幾十Da的糖化修飾峰）。穩(wěn)定性實驗中，通過CIEX-MS分析，能夠觀測到堿性峰中的琥珀酰亞胺中間體產(chǎn)物的增加（圖b）；加速穩(wěn)定性實驗中，能夠觀測到抗體片段的變化（圖c）。

圖a.CIEX-MS分析多種單抗混合物（點擊查看大圖）

圖b.CIEX-MS分析抗體穩(wěn)定性實驗中的堿性峰變化（點擊查看大圖）

圖c.CIEX-MS分析抗體加速穩(wěn)定性實驗中的片段峰變化（點擊查看大圖）

總結(jié)

生物大分子完整分子量分析在工業(yè)界已是一種廣泛認(rèn)可的分析方法，多樣性的前端液相串聯(lián)質(zhì)譜（如反相，離子交換，體積排阻色譜等）平臺已被開用應(yīng)用。基于orbitrap的質(zhì)譜平臺能夠獲得更高分辨及穩(wěn)健性的數(shù)據(jù)，且能夠在不同orbitrap質(zhì)譜型號間進(jìn)行方法轉(zhuǎn)換。對于完整蛋白糖型表征，抗體片段分析，琥珀酰胺化修飾、氧化修飾等雜質(zhì)能夠進(jìn)行高通量且準(zhǔn)確分析。

PRCR技術(shù)與MS3在抗體Middle-down蛋白分析中的應(yīng)用

ASMS 2019，賽默飛重磅推出三合一系列的創(chuàng)新dian峰之作——Thermo Scientific™ Orbitrap Eclipse™質(zhì)譜儀，*的PTCR技術(shù)可通過氣相的離子-離子相互作用，將蛋白質(zhì)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移給特定的化合物（C??F??），從而造成蛋白質(zhì)本身電荷減少，得到一系列的電荷減少離子。

采用Middle-down質(zhì)譜分析減少了樣品前處理操作，降低了人為引入翻譯后修飾的風(fēng)險，可以更好的獲取抗體的序列信息。結(jié)合使用PTCR技術(shù)后，通過降低母離子和/或子離子的價態(tài)，幫助解析復(fù)雜的MS及MS?譜圖，可檢測到更多的母離子及碎片，對結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及生物制藥的應(yīng)用大有助益。

講座中簡要介紹PTCR技術(shù)結(jié)合MS3與SPS同步母離子掃描技術(shù)在Middle-down蛋白分析中的應(yīng)用。PTCRMS3分析策略如下，方法設(shè)置中shou選會用四極桿選擇某一價態(tài)的母離子，隨后根據(jù)方法設(shè)置按照不同的碎裂模式，如ETD，HCD，UVPD進(jìn)行二級碎裂，產(chǎn)生的碎片離子與PTCR離子發(fā)生三級反應(yīng)，獲得的碎片離子進(jìn)入Orbitrap進(jìn)行質(zhì)量分析。

以NIST mAb為例，進(jìn)行middle-down分析前，先使用Ides酶對單抗進(jìn)行酶切，然后將單抗還原成LC，F(xiàn)d，F(xiàn)c三條分子量約為25kDa的亞基。以分子量大的Fd的序列覆蓋結(jié)果為例，單獨使用ETD的Fd序列覆蓋度為52%。ETD碎裂模式結(jié)合PTCR-MS3可以將序列覆蓋度提高至63%，同時使用PTCR后對于分子量大于5kDa的碎片識別率有了顯著的提高。

PTCR與HCD碎裂模式聯(lián)合使用時，同樣也會提高鑒定效率。以Fd為例，PTCR-MS3雖然只是略微增加了Fd的序列覆蓋度，但是互補(bǔ)離子對的數(shù)量有了顯著增加，從0對增加到了7對。結(jié)合兩者的數(shù)據(jù)可以將序列覆蓋度增加到41.6%，同時互補(bǔ)離子對增加到8對。

PTCR與UVPD聯(lián)合使用時，可以將LC的序列覆蓋度從64.6%提高至74%。將單用UVPD和PTCR聯(lián)用的結(jié)果整合，則可以將LC的序列覆蓋度提高至84.4%，互補(bǔ)離子對的數(shù)量也有了顯著增加。

常規(guī)的PTCR-MS3分析會將二級碎片按照質(zhì)荷比進(jìn)行分段，成為兩個質(zhì)譜分析方法，分多針進(jìn)樣分析。為了減少進(jìn)樣數(shù)量，在一針方法里實現(xiàn)多段質(zhì)量軸的二級碎片的PTCR反應(yīng)，可結(jié)合SPS同步母離子掃描技術(shù)。以UVPD碎裂為例，將SPS窗口設(shè)置為目標(biāo)質(zhì)量范圍，實現(xiàn)一針進(jìn)樣，多段分子量的PTCR分析。

SPS結(jié)果顯示，優(yōu)化了PTCR和UVPD反應(yīng)時長后，可以實現(xiàn)LC 54%的序列覆蓋，雖然不及多針進(jìn)樣模式下的結(jié)果，但仍然可以看出SPS技術(shù)應(yīng)用在PTCR分析中，減少進(jìn)樣數(shù)量、縮短進(jìn)樣時間的可能性。

總結(jié)

Eclipse上*的PTCR（質(zhì)子轉(zhuǎn)移電荷減少）技術(shù)可以將蛋白上的質(zhì)子轉(zhuǎn)移給特定離子，簡化蛋白分析中原本十分復(fù)雜的質(zhì)譜圖。聯(lián)合PTCR與其他碎裂模式（ETD，HCD，UVPD），使二級碎片與PTCR離子發(fā)生三級反應(yīng)，降低碎片譜圖的復(fù)雜程度，可增加抗體蛋白middle-down分析的序列覆蓋度。

學(xué)習(xí)使人快樂，通過四期的分享，希望大家都能從中獲得快樂。

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