本文共分為了四個(gè)部分：色譜法總論、氣相色譜法、高效液相色譜、質(zhì)譜分析法，共涉及了104個(gè)色譜分析的相關(guān)知識(shí)點(diǎn)。因文章內(nèi)容過(guò)長(zhǎng)，將分為兩期內(nèi)容供粉絲們查閱。

高效液相色譜法

與氣相色譜相比液相色譜的優(yōu)點(diǎn)

與氣相色譜法相比，液相色譜法不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性及相對(duì)分子質(zhì)量的限制，只要求把樣品制成溶液即可，非常適合于分離生物大分子、離子型化合物，不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物以及其他各種高分子化合物等。此外，液相色譜的流動(dòng)相不僅起到使樣品沿色譜柱移動(dòng)的作用，而且與固定相一樣，與樣品分子發(fā)生選擇性的相互作用，這就為控制和改善分離條件提供了一個(gè)額外的可變因素。而氣相色譜法采用的流動(dòng)相是惰性氣體，對(duì)組分沒(méi)有親和力，僅起運(yùn)載作用。

液相色譜特點(diǎn)：

高壓、高速、高效、高靈敏度、高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。

高效液相相色譜儀的組成：

高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

流動(dòng)相使用前必須脫氣：

常用的脫氣方法有：低壓脫氣法(電磁攪拌、水泵抽空，可同時(shí)加熱或向溶劑吹氮?dú)?、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。

梯度洗脫：

用兩種(或多種)不同極性的溶劑，在分離過(guò)程中按一定程序連續(xù)改變流動(dòng)相中溶劑的配比和極性，通過(guò)流動(dòng)相中極性的變化來(lái)改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。

高壓梯度(內(nèi)梯度)

特點(diǎn)是先加壓后混合，將溶劑用高壓泵增壓以后輸入色譜系統(tǒng)的梯度混合室，加以混合后送入色譜柱。

低壓梯度(外梯度)：

特點(diǎn)是先混合后加壓。在常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)⑷軇┗旌虾笤儆帽幂斎肷V柱。

進(jìn)樣系統(tǒng)要求：

良好的密封性，小的死體積，良好的穩(wěn)定性，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)壓力、流量影響較小。

分離系統(tǒng)：

色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件。由柱管和固定相組成。柱管為直型不銹鋼管。一般色譜柱長(zhǎng)5~30cm，內(nèi)徑4~5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3~12mm，而制備色譜柱內(nèi)徑則可達(dá)25mm。一般淋洗溶劑在進(jìn)入色譜分離柱之前，先通過(guò)前置柱。HPLC柱的填料顆粒粒徑一般約為3~10μm，填充常采用勻漿法，色譜柱的發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

檢測(cè)系統(tǒng)：

作用——用來(lái)連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。紫外-可見(jiàn)吸收檢測(cè)器、光電二極管陣列檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器。

高效液相色譜法對(duì)流動(dòng)相的要求：

流動(dòng)相不與色譜柱發(fā)生不可逆化學(xué)變化，以保持柱效或柱子的保留性質(zhì)較長(zhǎng)時(shí)間不變;對(duì)待測(cè)樣品有足夠的溶解能力；與所用檢測(cè)器相匹配；粘度盡可能小，以獲得較高的柱效；流動(dòng)相純度要高，價(jià)格便宜，毒性小。

高效液相色譜法的固定相的分類(lèi)：

(1)按固定相承受壓力分：

剛性固體：以二氧化硅為基質(zhì)，可承受較高壓力，表面可鍵合各種功能官能團(tuán)——鍵合固定相，是目前應(yīng)用廣泛的固定相。

硬膠：主要用于離子交換色譜法和凝膠色譜法中，由聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)而成，可承受的壓力較低。

(2)按孔隙深度分：

表面多孔型：基體是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一層多孔活性物質(zhì)如硅膠、氧化鋁、聚酰胺、離子交換樹(shù)脂、分子篩等。

優(yōu)點(diǎn)：適用于快速分離、填充均勻緊密、機(jī)械強(qiáng)度高、能承受高壓，適于簡(jiǎn)單的樣品及常規(guī)分析；缺點(diǎn)：多孔層薄，進(jìn)樣量受限制；

全多孔型：由硅膠顆粒聚集而成，比表面積大，柱容量大，小顆粒全孔型固定相孔洞淺傳質(zhì)速率快，柱效高，分離效果好，適合于復(fù)雜樣品、痕量組分的分離分析，是目前HPLC中應(yīng)用廣泛的固定相。

液固吸附色譜法原理：

是以固體吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力，試樣分子被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)時(shí)，它將與流動(dòng)相溶劑分子在吸附劑表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附。分離過(guò)程是一個(gè)吸附-解吸的平衡過(guò)程。

液固吸附色譜法固定相：

通常是硅膠、氧化鋁、活性炭等固體吸附劑，硅膠較為常用；

流動(dòng)相：極性大的試樣需用極性強(qiáng)的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。

應(yīng)用：幾何異構(gòu)體分離和族分離，如農(nóng)藥異構(gòu)體；石油中烷、烯、芳烴的分離。不適于強(qiáng)極性的離子型樣品的分離，不適于分離同系物(因?yàn)?，它?duì)相對(duì)分子質(zhì)量的選擇性較小)。

液液分配色譜法原理：

根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不同實(shí)現(xiàn)分離，分配系數(shù)較大的組分保留值也較大。

液液分配色譜法流動(dòng)相：

流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者二者的極性相差越大越好。根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜(流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于強(qiáng)極性和中等極性組分分離)和反相分配色譜(流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性或弱極性組分分離)。

固定相：由載體和固定液組成。常用的固定液有b，b’-氧二bing腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鯊?fù)榈?span style="font-size:15px">。

應(yīng)用：同系物組分的分離。

化學(xué)鍵合固定相：

化學(xué)鍵合固定相是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成各種性能的固定相。

化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)：

固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高；能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫；表面較為均一。沒(méi)有液坑，傳質(zhì)快，柱效高；能鍵合不同基團(tuán)以改變其選擇性。

離子交換色譜法原理：

離子交換色譜法的固定相是離子交換樹(shù)脂，流動(dòng)相是水溶液，它是利用待測(cè)樣品中各組分離子與離子交換樹(shù)脂的親和力的不同而進(jìn)行分離的。

離子交換色譜法流動(dòng)相：

水的緩沖溶液，陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液；陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液；

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。

凝膠色譜法原理：

凝膠色譜法的固定相為多孔性凝膠類(lèi)物質(zhì)，流動(dòng)相為水溶液或有機(jī)溶劑，它是根據(jù)不同組分分子體積的大小進(jìn)行分離的。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰快；溶劑分子小，故在后出峰。全部在死體積前出峰；

凝膠色譜法流動(dòng)相：

能溶解樣品且與凝膠相似(潤(rùn)濕凝膠并防止吸附作用)、粘度小(增加擴(kuò)散速度)。

影響分離的因素與提高柱效的途徑:

(1)液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍左右，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。

(2)由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。

(3)液相色譜中，不可能通過(guò)增加柱溫來(lái)改善傳質(zhì)。

(4)恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的直接的因素。

(5)流速大于0.5cm/s時(shí), H～u曲線(xiàn)是一段斜率不大的直線(xiàn)。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。

(6)氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。

質(zhì)譜分析法

質(zhì)譜法定義：

是將待測(cè)物質(zhì)置于離子源中電離形成帶電離子，讓離子加速并通過(guò)磁場(chǎng)或電場(chǎng)后，離子將按質(zhì)荷比(m/z)大小分離，形成質(zhì)譜圖。依據(jù)質(zhì)譜線(xiàn)的位置和質(zhì)譜線(xiàn)的相對(duì)強(qiáng)度建立的分析方法稱(chēng)為質(zhì)譜法。

質(zhì)譜的作用：

準(zhǔn)確測(cè)定物質(zhì)的分子量；

質(zhì)譜法是wei一可以確定分子式的方法；根據(jù)碎片特征進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)分析。

質(zhì)譜分析的基本原理：

質(zhì)譜法是利用電磁學(xué)原理，將待測(cè)樣品分子解離成具有不同質(zhì)量的離子，然后按其質(zhì)荷比(m/z)的大小依次排列收集成質(zhì)譜。根據(jù)質(zhì)譜中的分子離子峰(M+)可以獲得樣品分子的相對(duì)分子質(zhì)量信息；根據(jù)各離子峰(分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰等)及其相對(duì)強(qiáng)度和氮數(shù)規(guī)則，可以確定化合物的分子式;根據(jù)各離子峰及物質(zhì)化學(xué)鍵的斷裂規(guī)律可以進(jìn)行定性分析和結(jié)構(gòu)分析；根據(jù)組分質(zhì)譜峰的峰高與濃度間的線(xiàn)性關(guān)系可以進(jìn)行定量分析。

質(zhì)譜分析的過(guò)程：

（1）進(jìn)樣，化合物通過(guò)汽化引入電離室；

（2）離子化，在電離室，組分分子被一束加速電子碰撞，撞擊使分子電離形成正離子；

（3）離子也可因撞擊強(qiáng)烈而形成碎片離子；

（4）荷正電離子被加速電壓V加速，產(chǎn)生一定的速度v，與質(zhì)量、電荷及加速電壓有關(guān)；

（5）加速正離子進(jìn)入一個(gè)強(qiáng)度為B的磁場(chǎng)(質(zhì)量分析器)，發(fā)生偏轉(zhuǎn)。

質(zhì)譜儀的組成：

真空系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源或電離室、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器。

真空系統(tǒng)作用：

是減少離子碰撞損失，若真空度低：大量氧會(huì)燒壞離子源的燈絲；會(huì)使本底增高，干擾質(zhì)譜圖；引起額外的離子-分子反應(yīng)，改變裂解模型，使質(zhì)譜解釋復(fù)雜化；干擾離子源中電子束的正常調(diào)節(jié)；用作加速離子的幾千伏高壓會(huì)引起放電等。

進(jìn)樣系統(tǒng)目的：

高效重復(fù)地將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低；間歇式進(jìn)樣系統(tǒng)——氣體及低沸點(diǎn)、易揮發(fā)的液體;直接探針進(jìn)樣——高沸點(diǎn)的液體、固體；色譜進(jìn)樣系統(tǒng)——有機(jī)化合物。

離子源或電離室：

作用是使試樣中的原子、分子電離成離子，其性能影響質(zhì)譜儀的靈敏度和分辨率本領(lǐng)。

電子電離源的特點(diǎn)：電離電壓：70eV；加一小磁場(chǎng)增加電離幾率；EI源電離效率高,碎片離子多，結(jié)構(gòu)信息豐富，有標(biāo)準(zhǔn)化合物質(zhì)譜庫(kù)；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便；樣品在氣態(tài)下電離，不能汽化的樣品不能分析，主要用于氣-質(zhì)聯(lián)用儀；有些樣品得不到分子離子。

化學(xué)電離源特點(diǎn)：

電離能小，質(zhì)譜峰數(shù)少，譜圖簡(jiǎn)單；強(qiáng)峰為(M+1)+準(zhǔn)分子離子峰；不適用難揮發(fā)試樣。

快原子轟擊源：

高能量的Xe原子轟擊涂在靶上的樣品，濺射出離子流。本法適合于高極性、大分子量、低蒸汽壓、熱穩(wěn)定性差的樣品，F(xiàn)AB一般用作磁式質(zhì)譜的離子源。

電噴霧源結(jié)構(gòu)：

噴嘴(金屬毛細(xì)管)，霧化氣，干燥氣。

原理：噴霧蒸發(fā)電壓。特點(diǎn)：ESI是軟的一種電離方式，只產(chǎn)生分子離子，不產(chǎn)生碎片離子；適用于強(qiáng)極性，大分子量的樣品分析，如，肽，蛋白質(zhì)，糖等；產(chǎn)生的離子帶有多電荷，尤其是生物大分子；主要用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，既用作液相色譜和質(zhì)譜儀之間的接口裝置，同時(shí)又是電離裝置。

場(chǎng)致電離源(FI)和場(chǎng)解吸電離源(FD)：

分子離子峰強(qiáng)；碎片離子峰少；不適合化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

基質(zhì)輔助激光解吸電離特點(diǎn)：

準(zhǔn)分子離子峰很強(qiáng)且碎片離子少。通常用于飛行時(shí)間質(zhì)譜，特別適合測(cè)定多肽、蛋白質(zhì)、多糖等的相對(duì)分子質(zhì)量。

質(zhì)量分析器作用：

將離子源產(chǎn)生的離子按質(zhì)荷比m/z的大小分開(kāi)。

單聚焦分析器：

離子的m/z與R，B，V有關(guān)。通過(guò)改變磁場(chǎng)可以把不同離子分開(kāi)。在一定磁感應(yīng)強(qiáng)度B下，改變加速電壓V可以使不同離子先后通過(guò)檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量掃描，得到質(zhì)譜。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便；只有方向聚焦，無(wú)能量聚焦，分辨率低。

雙聚焦分析器：

實(shí)現(xiàn)方向聚焦和能量(速度)聚焦；

對(duì)于動(dòng)能不同的離子，通過(guò)調(diào)節(jié)電場(chǎng)能，達(dá)到聚焦的目的。特點(diǎn)：分辨率高。

四級(jí)桿質(zhì)量分析器：

特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，體積小、重量輕，掃描速率快，適合與色譜聯(lián)機(jī)。

飛行時(shí)間質(zhì)量分析器：

特點(diǎn)：質(zhì)量范圍寬，掃描速率快，既不需磁場(chǎng)也不需電場(chǎng)，只需要直線(xiàn)漂移空間。

離子阱質(zhì)量分析器：

特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢測(cè)器。

特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于操作、靈敏度高。

質(zhì)譜的表示方法：

質(zhì)譜一般可用線(xiàn)譜或表譜兩種方法表示，常用線(xiàn)譜；線(xiàn)譜上的各條直線(xiàn)表示一個(gè)離子峰，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比m/z，縱坐標(biāo)為離子的相對(duì)強(qiáng)度(相對(duì)豐度)，一般將原始質(zhì)譜圖上強(qiáng)的離子峰定為基峰并定為相對(duì)強(qiáng)度100%，其他離子峰以對(duì)基峰的相對(duì)百分值表示。能夠很直觀地觀察到整個(gè)分子的質(zhì)譜全貌；質(zhì)譜表是用表格形式表示的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，質(zhì)譜表中有兩項(xiàng)即質(zhì)荷比及相對(duì)強(qiáng)度，對(duì)定量計(jì)算較直觀。

質(zhì)譜儀的分辨率：

分辨率(R)指質(zhì)譜儀能區(qū)別鄰近兩個(gè)質(zhì)譜峰的能力，對(duì)兩個(gè)相等強(qiáng)度的相鄰峰，當(dāng)兩峰間的峰谷不大于其峰高10%時(shí)，則認(rèn)為兩峰已經(jīng)分開(kāi)。

質(zhì)譜圖中主要離子峰的類(lèi)型：

分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰。

相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定：

分子離子峰的m/z相當(dāng)于該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量。

一般除同位素離子峰外，分子離子峰是質(zhì)譜圖中大質(zhì)荷比的峰，位于質(zhì)譜圖的右端。

確認(rèn)分子離子峰的方法：

(1)分子離子峰必須符合氮數(shù)規(guī)則：

有機(jī)化合物含有偶數(shù)個(gè)氮原子或不含氮原子，分子離子峰的m/z一定是偶數(shù);含奇數(shù)個(gè)氮原子，分子離子峰的m/z一定是奇數(shù)；

(2)分子離子峰與相鄰離子峰的質(zhì)量差應(yīng)合理，如，不可能出現(xiàn)比分子離子峰質(zhì)量小4～13個(gè)質(zhì)量單位的峰；

(3)當(dāng)化合物中含S，Br，Cl時(shí)，可利用M+(M2+)+等同位素離子峰的比例來(lái)確認(rèn)分子離子峰。

(4)改變質(zhì)譜儀的操作條件，提高分子離子峰的相對(duì)強(qiáng)度。

※采用化學(xué)電離源或降低電子轟擊源電壓可獲得較強(qiáng)的M+峰。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：

質(zhì)譜：純物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。

色譜：化合物分離，定性能力差。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：共同優(yōu)點(diǎn)，GC-MS、LC-MS、CE-MS，色譜是質(zhì)譜的進(jìn)樣及分離系統(tǒng)，質(zhì)譜是色譜的檢測(cè)器。

主要問(wèn)題：接口技術(shù)，除去色譜中大量的流動(dòng)相分子。

適用范圍：適用于揮發(fā)度低、難氣化、極性強(qiáng)、相對(duì)分子質(zhì)量大及熱穩(wěn)定性差的樣品。

無(wú)損檢測(cè)定義：

無(wú)損檢測(cè)技術(shù)即非破壞性檢測(cè)，就是在不破壞待測(cè)物質(zhì)原來(lái)的狀態(tài)、化學(xué)性質(zhì)等前提下，為獲取與待測(cè)物的品質(zhì)有關(guān)的內(nèi)容、性質(zhì)或成分等物理、化學(xué)情報(bào)所采用的檢查方法。

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