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實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀簡(jiǎn)介
一、引言
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱PCR）是一種在體外擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。自1983年誕生以來(lái)，PCR技術(shù)在生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)PCR已逐漸無(wú)法滿足對(duì)靈敏度、準(zhǔn)確性、定量能力的更高需求。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，簡(jiǎn)稱qPCR）應(yīng)運(yùn)而生。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是一種結(jié)合熒光探針或染料信號(hào)，實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增與實(shí)時(shí)檢測(cè)的高通量分子檢測(cè)設(shè)備。本文將圍繞其基本原理、儀器結(jié)構(gòu)、工作流程、數(shù)據(jù)分析、技術(shù)優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用等方面進(jìn)行系統(tǒng)介紹。
二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理
1. 核酸擴(kuò)增原理
實(shí)時(shí)熒光定量PCR與傳統(tǒng)PCR的基本擴(kuò)增機(jī)制相同，均基于三步循環(huán)：
變性（Denaturation）：高溫使雙鏈DNA分離為兩條單鏈；
退火（Annealing）：降低溫度，使引物結(jié)合到模板DNA上；
延伸（Extension）：DNA聚合酶延伸引物，合成新的DNA鏈。
每個(gè)循環(huán)都會(huì)使目標(biāo)DNA數(shù)量翻倍，經(jīng)過(guò)30~45個(gè)循環(huán)后即可獲得大量擴(kuò)增產(chǎn)物。
2. 熒光定量原理
實(shí)時(shí)PCR通過(guò)加入熒光標(biāo)記物，在每一輪擴(kuò)增過(guò)程中同步檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，從而反映DNA的累積量。其定量方式主要有兩種：
染料法（如SYBR Green）：染料可與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)出熒光，隨DNA濃度增加熒光增強(qiáng)。
探針?lè)ǎㄈ鏣aqMan探針、MGB、Molecular Beacon）：通過(guò)序列特異性探針的熒光信號(hào)變化監(jiān)控?cái)U(kuò)增，特異性更高。
熒光信號(hào)被檢測(cè)器記錄，繪制出擴(kuò)增曲線，從而實(shí)現(xiàn)定量分析。
三、儀器結(jié)構(gòu)與功能模塊
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要由以下幾個(gè)部分組成：
1. 熱循環(huán)模塊
負(fù)責(zé)提供精確的溫控環(huán)境，確保PCR擴(kuò)增反應(yīng)的溫度條件，包括變性、退火、延伸及熔解過(guò)程。該模塊通常采用半導(dǎo)體控溫系統(tǒng)，溫度控制精度在±0.1℃以內(nèi)。
2. 光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)
包含激發(fā)光源、濾光片、光路系統(tǒng)和熒光檢測(cè)器。激發(fā)光源（如LED或激光器）激發(fā)熒光染料，熒光信號(hào)通過(guò)濾光片傳輸?shù)紺CD或光電倍增管進(jìn)行記錄。多通道檢測(cè)系統(tǒng)可同時(shí)監(jiān)控多種熒光信號(hào)，用于多重PCR反應(yīng)。
3. 控制與分析軟件
用于實(shí)驗(yàn)設(shè)置、數(shù)據(jù)采集、擴(kuò)增曲線分析、Ct值計(jì)算、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立、熔解曲線繪制等。軟件界面通常具備參數(shù)可視化、結(jié)果導(dǎo)出、模板管理等功能。
4. 樣本模塊
樣本通常裝載于96孔、384孔或較小通量的反應(yīng)板、管條中，有些儀器還支持快熱系統(tǒng)以縮短反應(yīng)時(shí)間。
四、工作流程
1. 樣本準(zhǔn)備
提取目標(biāo)樣本中的DNA或RNA（RNA需逆轉(zhuǎn)錄為cDNA），并準(zhǔn)確定量。引物與探針設(shè)計(jì)需依據(jù)目標(biāo)序列，避免二聚體和非特異性結(jié)合。
2. 配制反應(yīng)體系
一般包括以下成分：
DNA模板
上下游引物
熒光染料或探針
PCR緩沖液、Mg2?、dNTPs
熱啟動(dòng)DNA聚合酶
3. 設(shè)置程序參數(shù)
包括初始變性時(shí)間、循環(huán)次數(shù)、各階段溫度與時(shí)間、熔解曲線分析等。染料和探針類型不同可能需要調(diào)整檢測(cè)通道。
4. 實(shí)驗(yàn)運(yùn)行與數(shù)據(jù)采集
儀器自動(dòng)完成循環(huán)擴(kuò)增和熒光信號(hào)采集，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過(guò)軟件分析數(shù)據(jù)，獲取Ct值、Tm值、擴(kuò)增效率等信息。
五、Ct值與定量原理
1. Ct值定義
Ct（Cycle threshold）值是指熒光信號(hào)超過(guò)背景閾值所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。Ct值越小，代表初始模板濃度越高。
2. 相對(duì)定量與絕對(duì)定量
相對(duì)定量：使用內(nèi)參基因作為對(duì)照，計(jì)算目標(biāo)基因的表達(dá)變化，常用2^-ΔΔCt方法。
絕對(duì)定量：通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，根據(jù)Ct值與模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)關(guān)系，精確測(cè)量未知樣本中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。
六、與傳統(tǒng)PCR的比較
| 項(xiàng)目 | 傳統(tǒng)PCR | 實(shí)時(shí)熒光定量PCR |
|---|---|---|
| 檢測(cè)方式 | 電泳后檢測(cè) | 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè) |
| 是否定量 | 否 | 是 |
| 靈敏度 | 中 | 高 |
| 特異性 | 依賴引物設(shè)計(jì) | 探針?lè)ㄌ禺愋愿?/td> |
| 時(shí)間成本 | 較長(zhǎng)（需電泳） | 較短（無(wú)需后處理） |
| 數(shù)據(jù)輸出 | 定性結(jié)果（條帶） | 定量曲線和Ct值 |
七、常見(jiàn)問(wèn)題與解決策略
1. 非特異性擴(kuò)增
可能由引物設(shè)計(jì)不當(dāng)、退火溫度過(guò)低或引物濃度過(guò)高引起，可通過(guò)優(yōu)化退火溫度、重新設(shè)計(jì)引物、調(diào)整引物濃度解決。
2. 引物二聚體產(chǎn)生
主要表現(xiàn)為熔解曲線出現(xiàn)低Tm值小峰，通過(guò)使用熱啟動(dòng)酶、優(yōu)化引物設(shè)計(jì)或調(diào)整PCR體系濃度可緩解。
3. 熒光信號(hào)弱
可能由反應(yīng)體系抑制、模板降解或引物效率低導(dǎo)致，需檢查模板質(zhì)量，優(yōu)化引物或提高反應(yīng)體系兼容性。
4. 多重通道串?dāng)_
應(yīng)校準(zhǔn)濾光片組或檢測(cè)通道，確保熒光染料之間不發(fā)生交叉干擾。
八、技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域
1. 基因表達(dá)分析
通過(guò)檢測(cè)不同處理、組織或時(shí)間點(diǎn)中基因的表達(dá)量變化，廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)通路研究等。
2. 病原體檢測(cè)
利用qPCR高靈敏度，可快速檢測(cè)病毒、細(xì)菌、真菌等病原體DNA/RNA，廣泛用于臨床診斷與疫情監(jiān)測(cè)。
3. 基因分型與突變分析
通過(guò)Tm值變化或探針結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別不同等位基因，用于SNP檢測(cè)、遺傳多態(tài)性研究。
4. 轉(zhuǎn)基因篩查
針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物中特定外源基因序列進(jìn)行檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)與溯源追蹤。
5. 微量核酸檢測(cè)
適用于循環(huán)DNA（cfDNA）、微量殘留病毒等極低拷貝數(shù)樣本的檢測(cè)，配合數(shù)字PCR可進(jìn)一步提高分辨率。
九、發(fā)展趨勢(shì)與技術(shù)創(chuàng)新
隨著分子診斷、個(gè)體化醫(yī)療等領(lǐng)域的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也不斷演進(jìn)，呈現(xiàn)出以下趨勢(shì)：
自動(dòng)化：集成樣本制備、擴(kuò)增和檢測(cè)，提高實(shí)驗(yàn)效率。
便攜化：發(fā)展移動(dòng)式實(shí)時(shí)PCR設(shè)備，適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求。
高通量：支持384孔板、多通道檢測(cè)，提高數(shù)據(jù)產(chǎn)出。
精準(zhǔn)分析：與數(shù)字PCR、高分辨率熔解曲線（HRM）技術(shù)結(jié)合，拓展應(yīng)用邊界。
十、結(jié)語(yǔ)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀通過(guò)結(jié)合熱循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)與熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了DNA擴(kuò)增的實(shí)時(shí)、定量分析，為科研、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、司法等多個(gè)領(lǐng)域提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。其高靈敏度、穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)可追溯性，使其成為現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的常用工具。未來(lái)，隨著自動(dòng)化與智能化水平的提升，實(shí)時(shí)PCR技術(shù)將在更多場(chǎng)景中發(fā)揮作用。
