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杭州實了個驗生物科技有限公司
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賽默飛熒光定量PCR儀（如QuantStudio系列）**時應(yīng)注意的關(guān)鍵事項，涵蓋設(shè)備使用、實驗準(zhǔn)備、數(shù)據(jù)分析、安全等方面：
一、實驗準(zhǔn)備階段
樣本與試劑準(zhǔn)備
樣本應(yīng)避免反復(fù)凍融，保持RNA/DNA質(zhì)量。
所有試劑應(yīng)解凍并混勻后再使用。
使用低吸附管或PCR專用耗材，減少吸附損失。
反應(yīng)體系設(shè)置
嚴(yán)格按照試劑說明書配制體系，注意引物、探針濃度。
使用去RNA酶/去DNA酶的無核酸水配制。
配置時操作應(yīng)在冰上進行，避免酶活性變化。
加樣操作
避免氣泡，影響熒光讀數(shù)。
封板前輕輕離心，確保液體在孔底。
使用光學(xué)封板膜，確保貼合緊密、無褶皺。
二、儀器操作階段
PCR板放置
保持板底清潔，避免灰塵、水漬影響檢測。
板放入儀器前注意方向正確，與軟件板圖一致。
通道設(shè)定
選擇與試劑染料匹配的熒光通道。
若為多重檢測，確保熒光染料無通道重疊。
擴增程序設(shè)置
根據(jù)反應(yīng)體系設(shè)定溫度和循環(huán)參數(shù)。
通常熒光采集設(shè)在延伸階段。
熔解曲線（如SYBR Green）
啟用熔解曲線分析可判斷擴增特異性。
單一峰形代表反應(yīng)特異性良好。
三、數(shù)據(jù)分析階段
Ct值判斷
Ct值過高（>35）應(yīng)考慮模板濃度、污染或反應(yīng)效率問題。
無模板對照應(yīng)無擴增曲線，否則懷疑污染。
擴增曲線觀察
正常擴增曲線呈“S"型。
曲線不規(guī)則或漂移可能因加樣誤差或設(shè)備問題。
標(biāo)準(zhǔn)曲線分析（絕對定量）
R2值應(yīng)接近1，擴增效率在90–110%之間較理想。
四、安全與維護
設(shè)備清潔
加熱模塊表面需定期擦拭。
避免液體流入樣本槽，若有泄漏立即處理。
避免交叉污染
區(qū)分模板制備區(qū)與擴增區(qū)。
使用過濾吸頭，勤更換手套。
試劑儲存
酶類試劑儲存于-20℃，避免頻繁凍融。
染料類避光保存，使用后立即蓋緊。
數(shù)據(jù)備份
定期導(dǎo)出實驗數(shù)據(jù)，避免軟件崩潰造成丟失。
軟件升級前應(yīng)先備份方法與結(jié)果文件。
