超氧陰離子自由基檢測(cè)試劑盒(磺胺微板法)
一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
超氧陰離子自由基作為生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基，可攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和聚不飽和脂肪酸等，使其交聯(lián)或者斷裂，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞， 與機(jī)體衰老和病變有很密切的關(guān)系，清除超氧陰離子自由基的研究已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。生物體內(nèi)的分子氧可以經(jīng)過單電子還原轉(zhuǎn)變?yōu)槌蹶庪x子自由基(O2-)，O2-既可以直接作用于蛋白質(zhì)和核酸等大分子，也可以衍生為羥自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫及脂質(zhì)過氧物自由基等對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能具有破壞作用的活性氧。
雅吉生物超氧陰離子自由基檢測(cè)試劑盒(磺胺微板法)又稱超氧陰離子產(chǎn)生速率檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè)原理是在酸性條件下，2 份O2-與羥胺反應(yīng)生成 1 份 NO2-，NO2-在對(duì)氨基苯磺酸和萘胺的作用下反應(yīng)生成粉紅色的偶氮物質(zhì)，以酶標(biāo)儀測(cè)定 530nm 處吸光度，在一定范圍內(nèi)顏色深淺與 O2-成正比，根據(jù) A530 及 NO2-和 O2-的相關(guān)反應(yīng)中物質(zhì)的量的關(guān)系，可算出樣品中O2-的濃度。該試劑盒主要用于測(cè)定植物組織中的超氧陰離子自由基含量或超氧陰離子的產(chǎn)生速率及清除能力。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
二、產(chǎn)品組成：
名稱規(guī)格 | 100T | 存儲(chǔ) |
試劑(A): NO2-標(biāo)準(zhǔn)(1mM) | 1ml | 4℃ |
試劑(B): O2- Lysis buffer | 250ml | 4℃ |
試劑(C): 羥胺溶液 | 5ml | 4℃ |
試劑(D): 氨基苯磺酸顯色液 | 5ml | 4℃ 避 光 |
試劑(E): 萘胺顯色液 | 5ml | 4℃ 避 光 |
使用說明書 | 一份 | |
三、自備材料：
1、蒸餾水
2、實(shí)驗(yàn)材料：植物組織(大豆、綠豆、玉米等葉片)、血液、組織樣本等
3、研缽或勻漿器
4、離心管或試管
5、低溫離心機(jī)
6、恒溫箱或水浴鍋
7、酶標(biāo)儀、96 孔板
四、操作步驟(僅供參考)：
1、準(zhǔn)備樣品：
①植物樣品：取正?；蚰婢诚碌男迈r植物組織，清洗干凈，擦干，切碎，迅速稱取 1~1.5g， 加入 2ml 預(yù)冷的O2- Lysis buffer 后冰浴條件下勻漿或研磨，4℃ 10000g 離心 10min，上清液即為超氧陰離子自由基提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測(cè)定，4℃保存，用于超氧陰離子自由基的檢測(cè)。
③高活性樣品：如果樣品中含有較高濃度的超氧陰離子自由基，可以使用 O2- Lysis buffer 進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>
2、配制系列 NO2-標(biāo)準(zhǔn)溶液：取出 NO2-標(biāo)準(zhǔn)(1mM)恢復(fù)至室溫后，以 NO2-標(biāo)準(zhǔn)(1mM) 按下表繼續(xù)稀釋：
加入物(μl) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
NO2-標(biāo)準(zhǔn)(1mM) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
蒸餾水 | 99 | 98 | 97 | 0.96 | 95 | 94 |
NO2-含量(μM) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
3、O2-加樣：按照下表設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的超氧陰離子自由基濃度過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置平行孔。
加入物(μl) | 空白孔 | 標(biāo)準(zhǔn)孔 | 測(cè)定孔 |
蒸餾水 | 100 | — | — |
系列 NO2-標(biāo)準(zhǔn)(1~6 號(hào)) | — | 100 | — |
待測(cè)樣品 | — | — | 25 |
O2- Lysis buffer | — | — | 25 |
羥胺溶液 | — | — | 50 |
混勻，25℃水浴孵育 20min。 | |||
氨基苯磺酸顯色液 | 50 | 50 | 50 |
萘胺顯色液 | 50 | 50 | 50 |
混勻，30℃水浴孵育 30min。 | |||
4、O2-測(cè)定：以空白調(diào)零，酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔 530nm 處吸光度(即為
A標(biāo)準(zhǔn)、A測(cè)定)。
五、計(jì)算：以系列 NO2-標(biāo)準(zhǔn)(1-6 號(hào)孔)含量(μM)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)定孔的吸光度進(jìn)而計(jì)算 NO2-含量。根據(jù)如下公式計(jì)算具體樣品中超氧陰離子自由基(O2-)的含量：
植物組織樣品 O2-(μM/g)=2×n×VT/(W×VS)
血清、尿液等樣品 O2-(μM/ml)=2×n×N/VS
超氧陰離子的產(chǎn)生速率的定義：每分鐘每克鮮重組織產(chǎn)生的超氧陰離子的物質(zhì)的量，計(jì)算公式如下：
超氧陰離子產(chǎn)生速率【μmol/(min*g)】=2×n×VT/(W×t×VS)
測(cè)得樣品中蛋白質(zhì)含量后，可用下面公式表示：
超氧陰離子產(chǎn)生速率【μmol/(min*mg)】=2×n×VT/(m×t×VS)
式中：2=NO2-與O2-間的化學(xué)計(jì)量數(shù)
n=從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的 NO2-含量(μM) VT=超氧陰離子自由基提取液總體積(ml) N=樣品稀釋倍數(shù)
W=樣品鮮重(g)
m=樣品中蛋白質(zhì)含量(mg)
t=樣品與羥胺的反應(yīng)時(shí)間(min)=20 VS=測(cè)定時(shí)加入提取液體積(ml)
六、注意事項(xiàng)：
1、 實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)盡量新鮮，如取材后不立即使用，應(yīng)存于 4℃。
2、 如果樣品中含有較多的葉綠素，會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果，可在加入羥胺溶液 25℃水浴孵育20min 萃取葉綠素，再行顯色反應(yīng)。
3、 如果沒有酶標(biāo)儀，也可以使用普通的分光光度計(jì)測(cè)定，但應(yīng)考慮最小檢測(cè)體積。
4、 所測(cè)樣本的濃度過高，應(yīng)用 O2- Lysis buffer 稀釋樣品后重新測(cè)定。
5、 氨基苯磺酸顯色液和萘胺顯色液有強(qiáng)烈的刺激性，盡量在通風(fēng)條件好的地方操作，用后需擰緊瓶蓋，避免揮發(fā)。
七、有效期：6 個(gè)月有效。4℃運(yùn)輸，4℃保存。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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