濃縮多肽與蛋白質(zhì)
你會是“旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)黨”還是“冷凍干燥黨”呢？
多肽與蛋白質(zhì)應(yīng)用
”
多肽和蛋白質(zhì)是自然界中四種基本分類的大分子之一。人們經(jīng)常研究它們作為潛在的治療藥物。在合成蛋白質(zhì)后，分離蛋白質(zhì)是一個關(guān)鍵步驟。為了確保高效的分離步驟，了解兩種常用干燥技術(shù)——旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥之間的差異非常重要。
蛋白質(zhì)在幾乎所有細胞的基本過程中起著重要作用，其中大部分信息都被編碼在核酸中，并由蛋白質(zhì)控制。蛋白質(zhì)由稱為氨基酸的組成單元構(gòu)成。在溶液中，蛋白質(zhì)形成高度有序的三維結(jié)構(gòu)，這與它們的生物功能密切相關(guān)。肽是蛋白質(zhì)的較小版本，因為它們包含較少的氨基酸。盡管肽的三維結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)簡單，但其生物重要性并不少于蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)和多肽在身體中負責各種生命必需功能和過程的重要分子，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、心率調(diào)節(jié)、食物攝入和生長。它們在生物醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、生物工程、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物傳遞、化妝品和營養(yǎng)等領(lǐng)域中也被廣泛應(yīng)用。例如胰島素或阿斯巴甜等分子是蛋白質(zhì)和多肽在藥物和食品應(yīng)用中被使用的大家所熟知的例子。
在藥物開發(fā)中，蛋白質(zhì)和多肽通常被認為是對抗各種疾病的有吸引力的治療藥物。在生物醫(yī)學(xué)或生物化學(xué)研究中，這些生物分子可以用作定量研究的參考物質(zhì)、細胞培養(yǎng)的生長因子和細胞因子、生化分析中的活性酶、分子移動的載體蛋白質(zhì)、阻斷通路的抑制劑或與抗體配對使用的抗原。
通過化學(xué)合成、利用重組微生物或無細胞表達系統(tǒng)進行制造，以及通過從其自然環(huán)境中提取，可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)和多肽的制造。適合的制造策略在很大程度上取決于所需分子的大小和化學(xué)特性。
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多肽與蛋白類樣品的常見濃縮法
制作多肽或蛋白質(zhì)需要進一步處理以達到高純度，進行下游分析。處理步驟包括純化、濃縮和制劑，如下圖所示：
濃縮步驟可以通過幾種技術(shù)來完成，如噴霧干燥、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、并行蒸發(fā)和凍干。在這篇文章中，我們將重點介紹旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和凍干這兩種技術(shù)，并以 R-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和 L-200 冷凍干燥機為例，對比二者的區(qū)別，找出最合適多肽和蛋白質(zhì)的濃縮方法。
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀
自從 50 年代末期，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀就被廣泛應(yīng)用于實驗室中，它是一種已知、可靠且堅固的技術(shù)。步琦作為其發(fā)明者，一直致力于開發(fā)最高質(zhì)量和強性能的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的過程是溶劑的減壓蒸發(fā)，然后溶劑蒸汽再冷凝回液體。
R-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 | ||
加熱溫度 | 室溫 -220℃ | |
水浴鍋大小 | 5L | |
旋轉(zhuǎn)速度 | 10-280 rpm | |
標準冷凝器面積 | 1500 cm² | |
升降方式 | 電動升降 | |
支持泡沫傳感器/自動蒸餾傳感器/蒸汽傳感器 | ||
支持7種不同冷凝器 | ||
支持開源型 API，能接入第三方控制設(shè)備 | ||
冷凍干燥
冷凍干燥，又稱為凍干，是一種最溫和的干燥方法。冷凍干燥的原理基于物質(zhì)直接從固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)的過程，稱為升華。首先，將產(chǎn)品冷凍，然后在降低的壓力環(huán)境中通過升華進行干燥。低壓使凍結(jié)溶劑直接轉(zhuǎn)變?yōu)檎羝?。在大多?shù)冷凍干燥應(yīng)用中，從產(chǎn)品中去除的溶劑是水。但是，其他溶劑如乙腈在一定程度上也可以使用。
L-200 冷凍干燥機 | ||
制冷能力 | ≥ 6公斤/24 小時 | |
冷阱溫度 | -55 攝氏度 | |
制冷面積 | 1410 cm² | |
抽真空時間 | （至0.1mbar） ≤ 10 分鐘 | |
系統(tǒng)zui di真空度 | ≤ 30 微米汞柱 | |
模塊化干燥室，丙烯酸室/阻塞裝置/加熱隔板/多歧管自由組合 | ||
支持 Infinite-Control TM 可遠程監(jiān)視樣品狀態(tài) | ||
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對比旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和冷凍干燥機的關(guān)鍵參數(shù)
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥之間的主要參數(shù)區(qū)別：
| 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 | 冷凍干燥機 |
可以達到的最小壓力 | 最小可達5 mabr | 最小可達 0.03 mbar |
溫度范圍 | 通常為 40-60℃ | 室溫 |
應(yīng)用范圍 | 干燥或濃縮 | 干燥 |
樣品準備 | 無需 | 需預(yù)凍 |
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)不同溶劑的速度：
| 常壓下溶劑的沸點（℃） | 蒸發(fā)速率（L/h） |
水 | 100 | 0.75 |
甲醇 | 64.7 | 1.8 |
乙醇 | 78.37 | 1.8 |
* 蒸發(fā)速度測得條件：水浴鍋60℃，冷卻溫度20℃，1L蒸發(fā)瓶，轉(zhuǎn)速280 rpm
通過上述的對比，再結(jié)合常見的處理步驟，我們很容易能找到合適我們多肽或蛋白質(zhì)樣品的濃縮方法。
處理時間：
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在濃縮和干燥時間上有非常明顯的優(yōu)勢，常規(guī)實驗量的反應(yīng)液（1L以內(nèi)），在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上可以在1小時以內(nèi)處理完畢。除此之外，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀免去了冷凍干燥的預(yù)凍步驟，可直接上機處理，這進一步加快了處理效率。
應(yīng)用范圍：
相對于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，冷凍干燥機在應(yīng)用面上會顯得狹窄很多。但其干燥樣品的程度，特別是針對含水量較高的樣品，冷凍干燥具有絕對的優(yōu)勢，這有助于后續(xù)的處理。因此在針對多肽和蛋白類化合物時，我們可以根據(jù)不同的步驟采取多種干燥手段。在純化分離前，往往有大量的液體樣品需要濃縮，才能保證樣品不在分離柱內(nèi)擴散，獲得較好的峰型，這時我們可以采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀來處理。而在純化分離完畢后，我們會獲得高純度的少量液體樣品，此時我們就可以采用冷凍干燥來處理。
溫度范圍：
溫度條件對于多肽和蛋白質(zhì)類的樣品至關(guān)重要，很多此類樣品無法承受過多的熱應(yīng)力。針對這類樣品，冷凍干燥機是適合的選擇，其室溫的處理條件可以杜絕樣品變性或分解的可能性。
我們可以通過下圖來查看最合適您的多肽和蛋白樣品的濃縮方式：
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多肽與蛋白濃縮的小貼士
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旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀小貼士
樣品起泡：
蛋白類樣品在蒸發(fā)過程中極易起泡，為了避免樣品暴沸，我們可以采用防暴沸傳感器或者E型冷凝器。
步琦 R-300 E 型冷凝器：
▲R-300 E 型冷凝器
E型冷凝器在冷凝器前連接了一個緩沖空腔，可以有效避免樣品暴沸進入蒸發(fā)瓶內(nèi)。
干燥樣品：
在干燥樣品的過程中，樣品容易附著在蒸發(fā)燒瓶上，特別是蛋白類的粘性樣品。為了防止這種情況發(fā)生，可以使用干燥型蒸發(fā)燒瓶。干燥蒸發(fā)燒瓶上有凸起的部分，可以減少粉末在玻璃壁上的堆積，配合 R-300 的正反轉(zhuǎn)干燥模式，可以進一步避免樣品凝結(jié)。
▲圖示：干燥型蒸發(fā)瓶
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冷凍干燥機小貼士
樣品表面積：
多肽和蛋白質(zhì)的干燥速率通常取決于表面積與樣品體積之比。表面積越大，樣品干燥越快，因為更多的水分子可以離開基質(zhì)。為了增加樣品在預(yù)凍過程中的比表面積，建議使用 R-300 的杜瓦罐套件，可同時實現(xiàn)高效預(yù)凍和高比表面積。
▲R-300 杜瓦罐套件
▲經(jīng)過杜瓦罐套件干燥的樣品（左）具有更大的比表面積
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結(jié)論
相信通過以上介紹，您已經(jīng)找到了適合自己蛋白或多肽樣品的濃縮與干燥的方法。如果您希望進一步為自己的應(yīng)用定制一套解決方案，歡迎關(guān)注我們的公眾號，了解更多蛋白與多肽樣品的相關(guān)信息。
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