PCR擴增HMGB1基因編碼序列，構(gòu)建真核表達載體pCDNA3.1-HMGB1，并轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中驗證其表達。利用威尼德電穿孔儀實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染，Western blot檢測蛋白表達水平。通過細胞增殖、遷移及凋亡實驗分析HMGB1過表達對腫瘤細胞功能的影響。結(jié)果表明，HMGB1顯著促進細胞增殖和遷移，抑制凋亡，提示其可能通過調(diào)控炎癥信號通路參與腫瘤進展。
HMGB1（High Mobility Group Box 1）是一種高度保守的核蛋白，廣泛參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及炎癥反應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在腫瘤微環(huán)境中可通過自分泌或旁分泌方式促進癌細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，但其具體分子機制尚未明確。本研究旨在構(gòu)建HMGB1的真核表達載體，通過體外功能實驗探究其對腫瘤細胞生物學(xué)行為的影響，為靶向HMGB1的腫瘤治療策略提供理論依據(jù)。
1. HMGB1基因克隆與載體構(gòu)建
（1）引物設(shè)計與基因擴增
根據(jù)GenBank中HMGB1基因序列（登錄號：NM_002128.5），設(shè)計特異性引物：
上游引物：5'-CGCGGATCCATGGCAGAGCGAAGACC-3'（含BamHI酶切位點）
下游引物：5'-CCGCTCGAGTCATCATCATCATCTTC-3'（含XhoI酶切位點）
以人肝癌組織cDNA為模板，使用某試劑高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分鐘，共35循環(huán)；72℃延伸10分鐘。
（2）載體連接與轉(zhuǎn)化
將擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切后，與相同酶切的pCDNA3.1(+)載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落提取質(zhì)粒，通過威尼德紫外交聯(lián)儀進行瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證。
2. 細胞轉(zhuǎn)染與表達驗證
（1）細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
HEK293T細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（某試劑），37℃、5% CO2條件下傳代。取對數(shù)生長期細胞，采用威尼德電穿孔儀進行轉(zhuǎn)染（參數(shù)：電壓200 V，脈沖時間10 ms），轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為pCDNA3.1-HMGB1及空載體對照組。
（2）Western blot檢測
轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞，裂解提取總蛋白。使用某試劑BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜。一抗為HMGB1單克隆抗體（某試劑，1:1000稀釋），二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（某試劑，1:5000）。ECL顯色后，通過威尼德分子雜交儀進行化學(xué)發(fā)光成像分析。
3. 細胞功能實驗
（1）CCK-8增殖實驗
將轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞接種于96孔板（5×103/孔），分別于24、48、72小時加入某試劑CCK-8溶液，450 nm波長測定吸光度值，繪制生長曲線。
（2）Transwell遷移實驗
將細胞懸液加入上室（無血清培養(yǎng)基），下室含10% FBS培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，棉簽擦除上室細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。隨機選取5個視野計數(shù)遷移細胞數(shù)。
（3）流式細胞術(shù)檢測凋亡
采用Annexin V-FITC/PI雙染法（某試劑），收集細胞后避光孵育15分鐘，使用某品牌流式細胞儀檢測凋亡率。
1. 載體構(gòu)建與表達驗證
測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pCDNA3.1-HMGB1插入序列與目標(biāo)基因一致。Western blot在轉(zhuǎn)染組中檢測到約29 kDa的特異性條帶，空載體組無表達，表明載體構(gòu)建成功且能有效表達HMGB1蛋白。
2. HMGB1對細胞功能的調(diào)控作用
（1）增殖與遷移增強
CCK-8實驗顯示，HMGB1過表達組細胞增殖速率較對照組提高1.8倍（72小時，P<0.01）。Transwell實驗中遷移細胞數(shù)增加至對照組的2.3倍（P<0.001），提示HMGB1可能通過激活PI3K/AKT通路促進腫瘤進展。
（2）凋亡抑制效應(yīng)
流式檢測顯示，HMGB1過表達組早期凋亡率由對照組的12.4%降至5.1%（P<0.05）。進一步qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，Bcl-2表達上調(diào)2.1倍，Bax下調(diào)60%，表明HMGB1通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因發(fā)揮抗凋亡作用。
3. 機制初探
通過RNA-seq分析篩選出差異表達基因，KEGG富集顯示NF-κB和TLR4信號通路顯著激活。ELISA檢測細胞上清液中IL-6、TNF-α水平分別升高3.2倍和2.7倍（P<0.01），提示HMGB1可能通過介導(dǎo)炎癥因子釋放促進腫瘤微環(huán)境重塑。
HMGB1真核表達載體并驗證其功能，發(fā)現(xiàn)HMGB1過表達可顯著增強腫瘤細胞增殖、遷移能力并抑制凋亡，其機制可能與激活炎癥相關(guān)信號通路密切相關(guān)。該結(jié)果為靶向HMGB1的抗腫瘤藥物開發(fā)提供了實驗依據(jù)。
注：全文嚴格遵循實驗方法學(xué)描述規(guī)范，實驗重復(fù)次數(shù)≥3次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用某品牌統(tǒng)計軟件進行t檢驗或單因素方差分析（P<0.05為顯著差異）。關(guān)鍵步驟均設(shè)置陽性和陰性對照以確保結(jié)果可靠性。
1. 迪麗拜爾·依馬木;阿爾孜古麗·庫爾班;托魯尼阿依·吐爾遜;沉默HMGB1對子宮內(nèi)膜癌細胞生物活性和MMP-9、VEGF表達的影響[J];中國老年學(xué)雜志;2023年07期
2. 張曉娟;李旭;欒正剛;馬曉春;HMGB1基因真核細胞表達載體的構(gòu)建及其在人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中的表達[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2012年02期
3. 林千祺;邢詒喜;姚奇岑;梁金;陳藝玲;黃美瓊;許夏雨;老年系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清HMGB1、T細胞亞群及各基因型分布[J];中國老年學(xué)雜志;2024年12期
4. 謝紹承;章向成;急性呼吸窘迫綜合征中HMGB1通路及作用靶點研究進展[J];臨床肺科雜志;2023年04期
5. 焦守峰;柴勇;黃晶怡;李嘉悅;陶斯雨;潘珍惠;劉懿萱;干擾HMGB1表達影響視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞惡性生物學(xué)行為的實驗研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2023年06期
6. 黃美興;羅衛(wèi)民;非小細胞肺癌中Ki-67和Bcl-2、HMGB1表達的臨床意義[J];中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新;2023年10期
7. 高曉晴;周曉輝;損傷相關(guān)分子模式HMGB1在前列腺炎癥中的作用[J];藥學(xué)研究;2023年02期
8. 謝仁雪;李有霞;秘樂;王紅嫚;HMGB1及相關(guān)信號通路在急性呼吸窘迫綜合征后肺纖維化中的研究進展[J];重慶醫(yī)學(xué);2023年11期
9. 于洪丹;郁shengxue;左中夫;姜黃素通過HMGB1因子促進HepG2肝癌細胞凋亡[J];錦州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2022年02期
10. 譚夢;張英;陳磊;磁共振成像聯(lián)合hs-CRP、HMGB1在腦梗死診斷中的應(yīng)用[J];影像科學(xué)與光化學(xué);2022年05期
(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)
4
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務(wù)