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一、實驗原理

?鎳柱純化實驗的原理基于固定化金屬離子親和色譜(IMAC)?，這是一種利用金屬離子與配體之間的特異性相互作用來分離蛋白質的方法。鎳柱純化利用Ni2+與帶有咪唑基團的組氨酸(His)標簽的蛋白質之間的相互作用，從而實現(xiàn)目的蛋白的純化。具體來說，鎳柱中含有Ni2+離子，這些離子能夠與組氨酸上的咪唑基團形成配位鍵，從而選擇性結合帶有His標簽的目的蛋白。由于不帶His標簽的蛋白無法與Ni2+形成配位鍵，因此能夠有效地區(qū)分目的蛋白與非目的蛋白。

在純化過程中，首先通過Binding buffer平衡鎳柱，接著將蛋白質樣品上樣到鎳柱上。此時，帶有His標簽的目的蛋白會與鎳柱上的Ni2+結合，而非目的蛋白則流穿鎳柱。隨后，通過增加咪唑濃度的Washing buffer洗去非特異性結合的雜蛋白。最后，使用高濃度的咪唑緩沖液（Elution buffer）與His標簽競爭結合Ni2+，從而將目的蛋白洗脫下來，完成純化過程。

二、操作步驟

① 準備工作：

（1）根據(jù)目的蛋白的性質，選擇合適的鎳柱類型和洗脫方式，配制合適PH值的緩沖液和洗脫液。

（2）緩沖液和洗脫液在蛋白純化操作前用0.45 μm或0.22 μm濾頭過濾除菌避免污染鎳柱，減少壽命。

② 樣品預處理：

預處理待純化的蛋白樣品，如離心去除雜質、調整樣品的pH值、低濃度咪唑溶液透析以去除培養(yǎng)基中的EDTA和鹽溶液等（具體操作需根據(jù)蛋白性質設計）。

③ 鎳柱平衡及上樣：

利用無咪唑或低濃度咪唑的緩沖液對鎳柱進行平衡，待曲線維穩(wěn)10 min左右，即平衡結束。平衡完成后，將處理完畢的樣品緩慢且勻速地加入鎳柱中，使目的蛋白與鎳柱充分結合。

④ 除雜：

使用低濃度咪唑緩沖液（如2、5 、10、20、25 mM咪唑）沖洗鎳柱，去除與鎳柱非特異性結合的雜蛋白。該過程應合理控制流速和時間，以確保雜蛋白被wan全去除。

⑤ 洗脫：

為收集高純度的目的蛋白，使用含有高濃度咪唑的洗脫液將目的蛋白從鎳柱上洗脫下來。通過梯度洗脫的方式，逐步增加洗脫液中咪唑的濃度（如50、100、200、300、400、500 mM咪唑）。在目的蛋白shou次純化實驗中，應設置多個從低至高咪唑濃度的緩沖液，探索合適的洗脫條件。

⑥ 收集與分析：

收集含目的蛋白的洗脫液樣品，利用SDS-PAGE電泳等方法對其進行分析以評估其純度和濃度。

⑦ 清洗與保存：

使用ddH₂O沖洗鎳柱，并用20%乙醇溶液沖洗并保存鎳柱以防止微生物生長。

三、注意事項

① 在實驗前查詢并了解目的蛋白的性質（分子量、等電點、氨基酸組成、聚體等），并嚴格控制實驗條件，如緩沖液的pH值和咪唑濃度，以確保實驗的準確性和可重復性。

② 嚴格按照說明書操作，并且樣品在上柱前需要進行預處理（高速離心、調PH或透析等），以保護鎳柱，避免污染和損傷。

③ 在鎳柱的使用中，應避免緩沖液中存在還原劑和螯合劑，以免 Ni²⁺ 被還原而脫落。

④ 鎳柱純化的效率受到多種因素的影響，包括蛋白質表面可結合的氨基酸的種類、數(shù)目和分布，金屬離子的種類和密度，以及層析條件（如pH值、鹽的種類和濃度、添加劑等）。通過優(yōu)化這些條件，可以提高純化的效率和目的蛋白的純度。此外，鎳柱在使用一段時間后可能需要再生，以去除積累的雜蛋白并重新活化鎳柱，以保證其長期有效的使用?。

⑤ 盡量收集鎳柱純化過程中每一步產(chǎn)生的洗脫液，以便實驗結束后利用SDS-PAGE等方法對蛋白純化過程進行進一步分析。

四、緩沖液推薦

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