一、前言
在質(zhì)粒提取中，其原理是基于生物大分子在物理和化學(xué)性質(zhì)上的差異，通過變性、復(fù)性、沉淀和純化等實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行區(qū)分、提取。蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境下容易發(fā)生變性，使用 SDS (十二烷基硫酸鈉)等去垢劑破壞細(xì)胞膜時(shí)，SDS 與蛋白質(zhì)發(fā)生變性，形成復(fù)合物，使其沉淀；RNA 通常會(huì)加入 RNase 降解 RNA，但一般 RNase 的加入時(shí)間通常在細(xì)菌/細(xì)胞裂解之后、質(zhì)粒 DNA 純化之前，以確保 RNA 被充分降解；最關(guān)鍵的問題是: 如何將染色體 DNA 和質(zhì)粒 DNA 區(qū)分出來？
二、如何區(qū)分染色體DNA和質(zhì)粒DNA
細(xì)菌沒有細(xì)胞核，只有一個(gè)擬核(nucleoid)，而染色體 DNA 是環(huán)狀的，但并非裸露的，上面結(jié)合有多種 NAPs(nucleoid-associated proteins)。NAPs 和基因轉(zhuǎn)錄活性可以改變擬核的形態(tài)結(jié)構(gòu)。這樣的話，質(zhì)粒 DNA 就要簡單很多，游離于細(xì)胞質(zhì)中，以共價(jià)閉環(huán) cccDNA(convalently closed circular DNA)的形態(tài)存在。
在強(qiáng)堿和 SDS 的條件下，染色體 DNA會(huì)被降解成線性片段并發(fā)生變性。當(dāng)加入中和液(如醋酸鈉)后，染色體 DNA 雖然會(huì)復(fù)性，但無法恢復(fù)其原始的雙鏈結(jié)構(gòu)，而是形成一團(tuán)纏繞在一起無法溶解的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過高速離心，這些變性的染色體 DNA 會(huì)與 SDS-protein 復(fù)合物一起沉淀到管底，從而與質(zhì)粒 DNA 分離；然后在強(qiáng)堿環(huán)境下，質(zhì)粒 DNA雖然也發(fā)生一定程度的變性，但其兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)緊密盤繞在一起，保持雙鏈結(jié)構(gòu)，加入中和液后，質(zhì)粒 DNA 能夠迅速復(fù)性，恢復(fù)其天然的雙鏈結(jié)構(gòu)，并以溶液狀態(tài)存在于上清液中，通過后續(xù)純化步驟(過柱或磁珠吸附)，可以進(jìn)一步獲得高純度的質(zhì)粒 DNA。
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