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            首頁   >>   技術(shù)文章   >>   原代細胞如何獲取?

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            原代細胞如何獲???

            閱讀:1040      發(fā)布時間:2023-8-17
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            原代細胞(primary cell):是指從機體的組織(如人組織、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個細胞并在體外進行模擬機體培養(yǎng)的細胞,稱為原代細胞。一般認為,培養(yǎng)的原代的第1代細胞和傳代到第10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。

            原代細胞的獲取難度大、需要考慮的問題多,原代細胞如何獲?。?/span>

            原代細胞的獲取,就是從活體上將組織分解成單個細胞再進行培養(yǎng)的過程,且整個過程要求無菌操作。具體要考慮的問題有:組織分解的方式,培養(yǎng)的時間,換液時間,細胞狀態(tài)判斷和凍存。

            一、組織分解的方式

            將組織分解成單個細胞的方式目前主要有兩種:酶消化法和組織塊法(針對貼壁細胞)。

            1. 酶消化法:所用試劑:膠原酶和胰酶。

             膠原酶的選擇:(根據(jù)自己的組織樣本選擇合適的膠原酶是實驗成功的大前提。)

            類型

            適用組織

            膠原酶

            上皮、肺,脂肪和腎上腺組織細胞的分離.

            膠原酶

            軟骨,肝臟,骨,甲狀腺,心臟和唾液腺組織細胞的分離。

            膠原酶

            消化組織中連接部分使其成為單個細胞,用于哺乳動物組織細胞解離

            膠原酶

            多種組織。

            膠原酶

            胰腺小島組織的分離,將結(jié)締組織分離成單個細胞。

            膠原酶的配制:常用的是DMEM進行配制,配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱(注意現(xiàn)用現(xiàn)配)。

            膠原酶消化時間:根據(jù)組織特性,消化時間會有差異。以小鼠腎細胞為例,加入膠原酶Ⅰ進行消化后,放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右,期間每隔10min中震蕩一次,知道組織塊幾乎wan全消失為止(若是組織塊剪得非常細小,時間可以短一些,30min左右即可)。

            培養(yǎng)過程:注意原代細胞在培養(yǎng)2天后可能會出現(xiàn)細胞液變黃(橘黃色)的現(xiàn)象,且無漂浮物,這是正?,F(xiàn)象哦,不是污染。這是由于細胞在貼壁生長過程中釋放了CO2和其他物質(zhì)導致培養(yǎng)液PH發(fā)生了改變,所以變黃。

            2. 組織塊法

            取材:取組織中間部位,剪成大小均勻的小方塊(1~4mm2),清洗干凈后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中,在培養(yǎng)皿中各組織塊要排列均勻。 

            加液:培養(yǎng)液不能浸沒組織塊,避免組織漂浮。然后培養(yǎng)4h左右加培養(yǎng)液,培養(yǎng)48h后換液。

            二、培養(yǎng)時間

            無論是酶消化法還是組織塊法,取樣后培養(yǎng)時間最少需要一周以上的時間,期間可換液或者傳代。

            三、換液時間

            無論酶消化法還是組織塊法,在培養(yǎng)期間需要隨時關(guān)注細胞的生長狀況,需觀察其是否貼壁,是否污染,組織塊法要觀察是否有細胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。

            四、細胞狀態(tài)判斷

            正常貼壁細胞在培養(yǎng)幾天后,會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底,有的呈纖維狀,有的呈多邊形。這些細胞的狀態(tài)比較好,生長至80%~90%融合就可以傳代啦,傳代一次后的細胞會更干凈漂亮。

            五、凍存

            傳一代后的細胞(也可以不傳代直接凍存)培養(yǎng)至80%~90%便可凍存起來供后續(xù)實驗用。

            凍存液配制:不同的細胞可能會有不同的凍存液配制方案,各實驗室也有自己的凍存方案,

            常見的方案有:

            a: 10%DMSO+90%FBS;

            b: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM

            c: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS 。

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