細胞生物學、分子生物學
近年來，致力于活細胞成像（Live Cell Imaging *又被稱為活細胞成像、延時拍攝成像）的研究人員不斷增加。因為這種方式無需固定細胞，可觀察細胞原始結構變化。但是，以活細胞為對象的觀察難度高，會耗費很長的觀察時間，經常會有研究者因此失敗。
為此，我們特意面向備受活細胞成像失敗困擾及今后要開展相關實驗的人士，匯總了常見的3大失敗事例及其對策，現(xiàn)介紹如下。
活細胞成像的失敗事例1：細胞衰弱
活細胞成像的失敗事例2：焦點模糊
活細胞成像的失敗事例3：細胞逃離視野
使活細胞成像實驗效率大幅提高的方法
在活細胞成像期間或結束后查看細胞的情況，經常會發(fā)現(xiàn)細胞從中途開始衰弱、細胞死亡、細胞變?yōu)橐庀氩坏降臓顟B(tài)等現(xiàn)象。導致這些現(xiàn)象的原因可分為以下幾種。
熒光觀察時，激發(fā)光的波長越短或光照越強，對細胞造成的損傷也就越大。這就是所謂的“光毒性*1"，不僅會導致細胞因受損而衰弱、死亡，還有可能會造成出乎意料的影響。
對策
請盡可能使用靈敏度高的相機
請并用增益*2 、Binning*3 等設定，即使較弱的熒光也能感知
請盡量調弱激發(fā)光
進行拍攝設定時也請盡量避免照射激發(fā)光
請盡可能減少要拍攝的張數(shù)
不進行拍攝時請切斷激發(fā)光
*1：光毒性：通常指照射的光造成的損傷，但是在熒光觀察時，指細胞產生的活性氧使周圍的細胞遭受損傷。
*2：增益：對相機接收的信號進行放大。放大程度越高（調高增益），顯示的畫面越明亮。雖然像素數(shù)不會變，但是會產生噪點。
*3：Binning：虛擬地結合周圍的像素，放大單位像素接收的光信號的功能。噪點較調高增益時更少，但是像素數(shù)會減少。
多數(shù)細胞都喜歡與生物體內相同的環(huán)境。以人類細胞為例，在培養(yǎng)室及培養(yǎng)用恒溫箱中，基本上都需要滿足溫度37℃、二氧化碳濃度5%、濕度95%以上的條件。如果沒有穩(wěn)定供給這一條件，細胞就會衰弱，很難獲得準確數(shù)據(jù)。
對策
請使用可以穩(wěn)定提供適合環(huán)境（溫度、二氧化碳濃度、濕度）的培養(yǎng)室及恒溫箱
在室溫變化大的季節(jié)，請使用空調等保持室溫穩(wěn)定
請避免空調等的風直接吹到樣品。
使用多孔培養(yǎng)板時，請使用水分不會蒸發(fā)的型號
有的細胞容易受容器上附著的菌、污染物的影響。此外，移液管等實驗用器械可能也會導致支原體污染*4、交叉培養(yǎng)污染 *5。
對策
實驗時，請確保使用的容器、移液管等周邊用品設備均為無菌狀態(tài)
請盡量避免攜帶細胞移動
*4：支原體污染：由支原體引起的感染。在細胞株被污染的眾多原因中，是極為普遍的現(xiàn)象之一。
*5：交叉培養(yǎng)污染：正在操作中的細胞混入其他細胞。多為器械原因混入。
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耗時許久的實驗終于結束，一看得到的數(shù)據(jù)，卻發(fā)現(xiàn)焦點從中途就模糊了。這種現(xiàn)象是較多的失敗事例之一。許多研究者都經歷過這種失敗，但只要理解其中的原因，其實是可以主動避免的。
如果在接通裝置電源后馬上進行拍攝設定，焦點在設定期間可能就會發(fā)生偏移。這是因為接通電源后的一段時間內，容器內的培養(yǎng)液會發(fā)生對流，細胞也會移動。觀察設備等也會因溫度變化而出現(xiàn)一定的膨脹現(xiàn)象，使焦點發(fā)生偏移。在觀察漂浮細胞、粘附細胞時，都需要注意拍攝設定中與拍攝中的溫度偏差。
對策
請在放置細胞前用空容器暖機運行30分鐘，
暖機運行后放置細胞，在設定焦點等之前還要等待30至60分鐘
*7：溫度漂移：溫度變化導致漂浮的細胞運動的現(xiàn)象、因裝置自身的膨脹使對焦位置錯開的現(xiàn)象。
活著的細胞在分裂時尤其會朝上下方向（Z方向）運動。因此，如果在分裂的瞬間用高倍率進行單次自動對焦拍攝，焦點會發(fā)生偏移。
對策
請使用景深*8大的低倍鏡頭
如果是高倍率，請使用自動對焦功能或Z棧功能
在活細胞成像中采取上述預防措施，可切實防止焦點偏移。此時，為了盡量縮短照射激發(fā)光的時間，盡量縮小自動對焦及Z棧的設定范圍*9也是非常關鍵的。
*8：景深：表示對焦的范圍。一般NA越高景深越淺。
*9：Z棧的設定范圍：Z棧是對不同的Z位置數(shù)據(jù)進行多張拍攝的功能。拍攝范圍越大移動步徑越小，可獲得的信息越多，但是細胞的損傷也相應地增加，因此希望以盡可能少的張數(shù)進行設定。
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實驗后觀看數(shù)據(jù)時，有時會發(fā)現(xiàn)細胞已經中途移到了視野范圍外。要是細胞在目標現(xiàn)象尚未完成時發(fā)生了移動，就只能重做實驗。
實驗時間越長，細胞逃離視野范圍的可能性越高。只要細胞是活著的，就無法避免這一問題。相信大家都在各類論文中讀到過觀察細胞細節(jié)的數(shù)據(jù)。其中的絕大多數(shù)，都是通過高倍率反復進行多次拍攝后獲得的結果，需要耗費大量的時間和精力。
要切實避免失敗，較好的方法就是一次性拍攝多點，或者是讓視野追隨移動的細胞進行拍攝。
對策
請用倍率低的鏡頭拍攝大的視野
請一次拍攝多個部位
低倍率觀察時視野較大，細胞不易逃離視野，可切實捕捉細胞。但使用低倍率，卻無法觀察細胞的細節(jié)。曝光時間也會變長，如觀察對象在拍攝期間運動，圖像也可能會發(fā)生抖動*10，故請注意。
*10：曝光時間和圖像抖動：調弱激發(fā)光，曝光時間自然變長。如果在打開快門期間細胞動了，圖像就會抖動。要防止這種現(xiàn)象，使用高靈敏度的相機是一種有效的辦法。
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一直以來，要獲得更好的研究成果，就必須重復進行更多次的實驗，獲取更多的信息。但是活細胞成像實驗的單次耗時很長，多次重復會耗費大量的時間。特別理想的狀態(tài)，就是能夠在單次實驗中獲取盡可能多的信息。
基恩士的一體化熒光顯微成像系統(tǒng)“BZ-X800系列"，能夠解決活細胞成像“單次實驗可獲得的信息量"問題?？梢淮涡垣@取2倍、4倍、20倍等不同條件下最多999個點的數(shù)據(jù)。設定操作也很簡單，可縮短過去用于系統(tǒng)準備及使用者培訓的時間。
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