【產(chǎn)品名稱(chēng)】
通用名稱(chēng)：豬多殺性巴氏桿菌（SPA）核酸檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法)
Name：Swine Pasteurellosis Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
多殺性巴氏桿菌是一種常見(jiàn)病原菌，可感染豬、牛、家禽等多種動(dòng)物，引起豬肺疫、牛出血性敗血癥、禽霍 亂等多種臨床疾病[1]。
本試劑盒適用于檢測(cè)氣管分泌物拭子、肺組織等樣本中的豬多殺性巴氏桿菌，用于豬多殺性巴氏桿菌感染的 輔助診斷。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒采用 TaqMan 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)豬多殺性巴氏桿菌特異性引物，結(jié)合一條特異性探針[2]，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)豬多殺性巴氏桿菌的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于科研實(shí)驗(yàn)中對(duì)可疑感染者的病原學(xué)檢測(cè)。
【試劑組成】
包裝規(guī)格50T/盒
SPA 反應(yīng)液500μL×2 管
酶液50μL×1 管
SPA 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品250μL ×1 管
說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺豬，無(wú)菌采集肺病變部位或病變/非病變部位交界處的樣品；生豬滅菌棉拭子沾取氣管分泌物， 放入無(wú)菌試管中
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1.樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織樣品：稱(chēng)取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中
1.2核酸提取
推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取，請(qǐng)按照 試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；反應(yīng)管數(shù)每滿(mǎn) 10 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑SPA 反應(yīng)液酶液
用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21μL/管。
3.加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇
ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)
11 cycle95℃10min否
240 cycles94℃15sec否
55℃30sec是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線(xiàn)出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的Value 值(上下拖動(dòng)閾值線(xiàn)至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35，且曲線(xiàn)有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線(xiàn)；
可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線(xiàn)有明顯的增長(zhǎng)曲線(xiàn)， 判定為陽(yáng)性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。
6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：Ct 值>38 或無(wú) Ct 值；
陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
7.檢測(cè)方法的局限性
1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
2.樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；
3.陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；
4.病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；
7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
[1]曾靜雯, 劉慧芳, 沈琴芳, 等. 多殺性巴氏桿菌鑒定與特性研究的分子生物學(xué)方法[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2006.
[2]李鵬, 馬艷嬌, 夏偉, 等. 豬肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌和豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌三重 PCR 檢測(cè)方法的建立. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2010.
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