超氧陰離子清除能力試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
超氧陰離子自由基作為生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基，可攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和聚不飽和脂肪酸等，使其交鏈或者斷裂，引起細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，與機體衰老和病變有很密切的關(guān)系，清除超氧陰離子自由基的研究已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。
測定原理：
AP-TEMED系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，與鹽酸羥胺反應(yīng)生成NO2－，NO2－與對氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成紅色的偶氮化合物，在530nm處有特征吸收峰，樣品對超氧陰離子的清除能力與530nm的吸光值呈負相關(guān)。
自備實驗用品及儀器：
天平、研缽、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體1.5mL×1支，4℃避光保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加6mL蒸餾水充分溶解。
試劑三：液體7.5mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體7.5mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑五：液體7.5mL×1瓶，4℃避光保存。
樣品處理
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。
2. 細胞：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測。
4. 粉劑藥物可配制成相同濃度，比如1mg/mL。
測定操作
對照管 | 測定管 | |
試劑一（μL） | 10 | 10 |
試劑二（μL） | 40 | 40 |
H2O（μL） | 25 | |
充分混勻，25℃反應(yīng)1min | ||
樣品（μL） | 25 | |
試劑三（μL） | 50 | 50 |
充分混勻，37℃反應(yīng)30min | ||
試劑四（μL） | 50 | 50 |
試劑五（μL） | 50 | 50 |
充分混勻，37℃顯色20min，于微量石英比色皿/96孔板，在530nm處測定對照管和測定管的吸光值，分別記為A對照管和A測定管。 | ||
注意：對照管只需測定一次。
計算公式：
超氧陰離子清除率 I%=
注意事項：
1. 試劑一4℃可保存2個月，配制好的試劑二4℃可保存一周，建議實驗前配制，并盡快使用。
2. 樣品處理完后立即進行測定，或者低溫保存不超過24小時。
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