超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）試劑盒說明書（NBT 法）
微量法 100 管/96 樣
注 意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是 H2O2 主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。
測定原理：
通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，O2-可還原氮藍四唑生成藍色甲臜，后者在 560nm 處有吸收；SOD 可清除 O2-，從而抑制了甲臜的形成；反應液藍色越深，說明 SOD 活性愈低，反之活性越高。
需自備的儀器和用品：
酶標儀、離心機、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體 200μL×1 支，4℃保存；
試劑三：液體 4mL×1 瓶，4℃保存；
試劑四：粉劑×2 瓶，4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、 酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 560nm。
2、 將試劑二用蒸餾水稀釋兩倍，用多少配多少。（試劑二和蒸餾水 1：1 稀釋）
3、 將一瓶試劑四用 5mL 蒸餾水溶解（溶解后一周內(nèi)用完），再用蒸餾水稀釋 4 倍，用多少配多少（試劑四和蒸餾水 1：3 稀釋）。
4、 測定前將試劑一、三和四在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）水浴 5min 以上。
5、樣本測定（在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列試劑）
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
試劑一 | 45 | 45 |
試劑二 | 2 | 2 |
樣本 | 18 | |
蒸餾水 | 18 | |
試劑三 | 35 | 35 |
試劑四 | 100 | 100 |
充分混勻，室溫靜置 30min 后，560nm 處測定各管吸光值 A。
注意事項：
1、試劑二為酶，不可冷凍，使用時在冰上放置。
2、對照管只需要做一管。
3、若對照管吸光值大于 1，建議將試劑二用蒸餾水稀釋 7 倍后使用（10μL 試劑二原液+60μL蒸餾水）。
4、SOD 為什么有的樣本測定管大于對照管，對照管數(shù)值在什么范圍？
對照管的范圍是 0.4-1。對照管吸光值過低可能是
（1）試劑二或試劑四沒有現(xiàn)配現(xiàn)用；
（2) 沒有按順序加試劑；
（3）反應時間不夠，可以延長反應時間（反應時間 30min 可以延長到 40min）。對照管吸光值過高可能是試劑二未按操作說明書稀釋相應倍數(shù)。若出現(xiàn)測定管大于對照管，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10 倍后再測，通?？梢允箿y定正常。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。
SOD 活性計算：
1、抑制百分率的計算
抑制百分率＝(A 對照管－A 測定管) ÷A 對照管× 100%
盡量使樣本的抑制百分率在 10-90%范圍內(nèi)。如果計算出來的抑制百分率小于 10%或大于90%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當稀釋；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度比較高的待測樣本。
2、SOD 酶活性單位：
在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應體系中抑制百分率為 50%時，反應體系中的 SOD 酶活力定義為一個酶活力單位(U/mL)。
3、SOD 酶活性計算：
（1）血清（漿）SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷V 樣
=11.11×抑制百分率÷(1－抑制百分率)
（2）組織、細菌或培養(yǎng)細胞
SOD 活力計算：
a.按樣本蛋白濃度計算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)
=11.11×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
b.按樣本鮮重計算
SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(W ×V 樣÷V 樣總) =11.11×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W
c.按細菌或細胞個數(shù)計算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)
=0.022×抑制百分率÷(1－抑制百分率)
V反總：反應體系總體積，0.2mL；V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.018mL；
V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL ；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。
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