維生素B1（Vitamin B1，VB1）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
維生素B1（Vitamin B1）是構(gòu)成脫羧輔酶的主要成分，參與細胞代謝中的三羧酸循環(huán)，是維持機體正常代謝必須的水溶性維生素，在生物體能量代謝中有重要的作用。
測定原理：
VB1在堿性條件下還原鐵氰hua鉀生成亞鐵氰hua鉀，亞鐵氰hua鉀與Fe3+在弱酸條件下生成普魯士藍，在704nm有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器：
天平、研缽、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體70mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體1mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體2mL×1支，4℃保存。
試劑三：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑四：液體5mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：液體3mL×1瓶，4℃避光保存。
樣本處理：
1. 組織：將樣品磨碎，按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測定（動物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30min）。
2. 細胞：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入0.6mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測定。
3. 血清：直接測定。
測定操作：
空白管 | 測定管 | |
樣品（μL） | 20 | |
試劑一（μL） | 20 | |
試劑二（μL） | 16 | 16 |
試劑三（μL） | 20 | 20 |
充分混勻，80℃反應10min | ||
提取液（μL） | 16 | 16 |
試劑四（μL） | 44 | 44 |
試劑五（μL） | 24 | 24 |
H2O（μL） | 60 | 60 |
充分混勻，靜置20min，于微量石英比色皿/96孔板，蒸餾水調(diào)零，測定704nm處吸光值，記為A空白管和A測定管，△A=A測定管-A空白管。 | ||
計算公式：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.017x+0.0031，R2 = 0.9991；x為標準品濃度：μg/mL；y為△A（A測定管-A空白管）
1. 按照蛋白含量計算
VB1含量（μg/mg prot）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷Cpr
= 58.8×（△A-0.0031）÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計算
VB1含量（μg/g鮮重）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（W÷V樣總）
= 58.8×（△A-0.0031）÷ W
3. 按照細胞數(shù)量計算
VB1含量（μg/104 cell）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（細胞數(shù)量÷V樣總）
= 58.8×（△A-0.0031）÷ 細胞數(shù)量
4. 按照液體體積計算
VB1含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.017
= 58.8×（△A-0.0031）
V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g
b．用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線：y = 0.0085x +0.0031，R2 = 0.9991；x為標準品濃度：μg/mL；y為△A（A測定管-A空白管）
1. 按照蛋白含量計算
VB1含量（μg/mg prot）=（△A -0.0031）÷ 0.0085÷Cpr
= 117.65×（△A-0.0031）÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計算
VB1含量（μg/g鮮重）=（△A-0.0031））÷ 0.0085÷（W÷V樣總）
= 117.65×（△A-0.0031）÷ W
3. 按照細胞數(shù)量計算
VB1含量（μg/104 cell）=（△A-0.0031）÷ 0.0085÷（細胞數(shù)量÷V樣總）
= 117.65×（△A-0.0031）÷ 細胞數(shù)量
4. 按照液體體積計算
VB1含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.0085
= 117.65×（△A-0.0031）
V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g
注意事項：
1. 若測定結(jié)果中吸光值超過2，請將樣本稀釋后進行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2. 蛋白濃度較高的樣品，比如動物組織，若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生，將樣本稀釋后再重新測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
3. 顯色完成后立即進行測定。
4. 標準曲線線性范圍為0.1-10μg/mL。
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