乙醇含量測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
酒是含酒精（乙醇）飲料的統(tǒng)稱，乙醇是酒的主要成分，是衡量酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。我國是世界上Z早發(fā)明釀酒的國家，也是酒類產(chǎn)品消費大國，其消費量居世界zhi首。因此，快速、準確測定酒中乙醇含量，對于確保酒的質(zhì)量和保護消費者的健康具有重大意義。
測定原理：
乙醇在乙醇脫氫酶的催化下氧化脫氫生成乙醛，同時，NAD 被還原生成 NADH，NADH 在 1-mPMS 的作用下使 WST-8 顯橙黃色，通過 450 nm 下測定吸光值變化可測得乙醇含量。
需自備的儀器和用品：
酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰、蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體 12 mL×1 瓶,4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶, -20℃保存；臨用前加入 6 mL 試劑三充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存；
試劑三：液體 10 mL×1 瓶,4℃保存；
試劑四：液體 1.5mL×1 管， 4℃避光保存。
乙醇提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 蒸餾水），進行勻漿，8000g，25℃離心 10min，取上清待測。
2. 細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：蒸餾水體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 蒸餾水），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）， 8000g，25℃離心 10min，取上清待測。
3. 血清（漿）等液體樣品：直接測定。
測定步驟：
1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 450nm。
2. 工作液的配制：臨用前按照樣本數(shù)量，按以下比例配制工作液
試劑名稱 體積（μL）
試劑一 100
試劑二 50
試劑四 10
3. 樣本測定
按下表在 96 孔板中加入如下試劑
試劑名稱 體積（μL）
樣本 40
測定工作液 160
混勻后記錄 450nm 下測定初始吸光值 A1，和 37℃避光孵育 10min 后的吸光值 A2，計算△A=A2-A1。
乙醇含量計算：
標(biāo)準條件下測定回歸方程為 y = 0.0256x + 0.0055 | R2 = 0.9991； |
x 為乙醇含量（μmol/mL），y 為吸光值差值△A。
1. 按照血清（漿）體積計算
乙醇含量（μmol/mL）= (△A-0.0055)÷0.0256
=39.1×(△A-0.0055)
2. 按照樣品質(zhì)量計算
乙醇含量（μmol/g 鮮重）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷(W ×V1÷V2）
= 39.1×(△A-0.0055)÷W
3. 按照細菌或細胞密度計算
乙醇含量（μmol/104 cell）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷（500×V1÷V2）
=0.078×(△A-0.0055)
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL；V2：加入提取液體積，1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬；
注意事項：
測定前取 1-2 個樣做預(yù)實驗，若△A﹥0.3 或乙醇含量﹥10μmol/mL，需將樣本用蒸餾水稀釋后再測定，以確保測定的準確性。
Z低檢測限：0.02μmol/mL。
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