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            可溶性淀粉合成酶(SSS)試劑盒說明書

            閱讀:428      發(fā)布時間:2023-04-10
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            可溶性淀粉合成酶(Soluble starch synthaseSSS試劑盒說明書

                                                  微量法100/96

               意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

            測定意義

            SSSEC 2.4.1.21通常以游離態(tài)存在于質(zhì)體基質(zhì)中,催化淀粉鏈延長,主要負責支鏈淀粉的合成。

            測定原理

            SSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應,將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上,同時生成ADP,在反應體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH,NADPH生成量與前一步反應中ADP生成量呈正比,340nm下測定NADPH增加量即可計算SSS活性。

            需自備的的儀器和用品

            紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

            試劑的組成和配制

            提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

            試劑一:40mL×1瓶,4保存;

            試劑二:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入14mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

            試劑三:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入8mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

            試劑四:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入10mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

            試劑五:液體×1支,-20保存;臨用前加入500μL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

            試劑六:粉劑×1支,-20保存;臨用前加入500μL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融

            粗酶液制備

            按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。10000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

            測定步驟

            1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

            2、在EP管中按順序加入下列試劑

            試劑名稱μL

            測定管

            樣本

            75

            試劑二

            135

            混勻,30保溫20 min,置沸水浴中1 min(蓋緊,防止水分散失),冰浴冷卻

            試劑三

            75

            混勻,30保溫30 min,置沸水浴中1 min(蓋緊,防止水分散失),冰浴冷卻,10000g 4離心10min,取上清液(如果一次性測定樣本較多,可以將試劑四、五和六按比例配成混合液)

            上清液

            150

            試劑四

            100

            試劑五

            5

            試劑六

            5

            混勻后立即340 nm波長下記錄初始吸光度A1 2min后的吸光度A2,計算ΔA=A2-A1

            注意:試劑二如有沉淀,加入之前要使之充分溶解混勻。

            SSS活性計算

            a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

            1、按樣本蛋白濃度計算:

            單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

            SSSnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T×稀釋倍數(shù)

                           =529×ΔA÷Cpr

            此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

            2、按照樣本鮮重計算

            單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

            SSS活性(nmol/min /g 鮮重=[ΔA×V反總÷ε×d×109V÷V樣總×W÷T×稀釋倍數(shù)

                               =529×ΔA÷W

            V 反總:反應體系總體積,2.6×10-4 L;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.075 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;稀釋倍數(shù):1.9Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量。

            b.使用96孔板測定的計算公式如下:

            1、按樣本蛋白濃度計算:

            單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

            SSSnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T×稀釋倍數(shù)

            =1059×ΔA÷Cpr

            此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

            2、按照樣本鮮重計算

            單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

            SSS活性(nmol/min/g 鮮重=[ΔA×V反總÷ε×d×109V÷V樣總×W÷T×稀釋倍數(shù) =1059×ΔA÷W

            V 反總:反應體系總體積,2.6×10-4 L;εNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.075 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,2 min;稀釋倍數(shù):1.9Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量。


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