硝酸還原酶（Nitrate Reductase，NR）活性測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意：正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
NR（ EC 1.7.1.3）廣泛存在于植物中，是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶，也是誘導酶，對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響。
測定原理：
NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與對–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成紅色偶氮化合物；生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法測定。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
誘導劑儲備液：液體50mL×1瓶，4℃保存。
提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體10mL×1瓶，-20℃保存。
試劑二：液體5mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存（如出現(xiàn)結(jié)晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）；
試劑四：液體6mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：標準儲備液1mL，-20℃保存。
誘導劑應(yīng)用液的配制：用時將誘導劑儲備液稀釋10倍，即取10mL誘導劑儲備液加90mL蒸餾水，充分混勻。
0.1umol/mL的標準液的配制：用時將試劑五稀釋100倍，即取 0.1ml試劑五加9.9mL蒸餾水，充分混勻。
樣本前處理：
動植物組織樣品的前處理:
（1）取適量誘導劑于燒杯中，將新鮮標本洗凈，濾紙吸干，放入誘導劑應(yīng)用液中（淹沒即可），浸泡2h，取出樣本，濾紙吸干。
（2）按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
注意：
1、 建議使用新鮮沒有冷凍過的樣本。
2、 一般不要誘導處理，預測定結(jié)果沒有活性（A測定≤A對照管）則需要誘導處理。
細菌或培養(yǎng)細胞的前處理：
先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定（在EP管或96孔板中加入下列試劑）
試劑名稱（μL） | 加樣孔 | |||
測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 | |
樣本 | 20 | 20 | ||
0.1μmol/mL標準液 | 20 | |||
蒸餾水 | 75 | 95 | ||
試劑一 | 75 | 75 | ||
試劑二 | 25 | 25 | 25 | 25 |
混勻后，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）反應(yīng)30min
試劑三 | 50 | 50 | 50 | 50 |
試劑四 | 50 | 50 | 50 | 50 |
混勻，25℃室溫顯色20min，540nm處比色
注意：1、標準管和空白管只需測一次，每個測定管設(shè)一個對照管。
2、誘導處理后的樣本對照管中試劑二改成加25μL蒸餾水。
NR活性計算：
（1）按樣本鮮重計算：
單位定義：每小時每g鮮重樣品中催化產(chǎn)生 1μmol NO2ˉ的量為一個 NR活力單位。
NR（μmol/h/g 鮮重）= (C標準管×V1)×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算：
單位定義：每小時每mg組織蛋白催化產(chǎn)生 1μmol NO2ˉ的量為一個 NR活力單位。
NR（μmol/h/mg prot）=(C標準管×V1)×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷Cpr
C標準管：標準管濃度，0.1μmol/mL；V1：加入樣本體積：0.02mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，0.5h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。
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