氨基比林-N-脫甲基酶（AND）活性測定試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
細胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員，相當于CYP3A4亞型，與藥物的去甲基化反應密切相關(guān)。
測定原理：
AND催化氨基比林釋放甲醛，通過Nash比色法測定甲醛含量，即可計算出AND活性。
自備儀器和用品：
普通離心機，超速離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇和冰。
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1管，4℃避光保存。臨用前加入1mL無水乙醇，充分溶解。
試劑四：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入0.5mL蒸餾水，充分溶解。
試劑五：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水4mL充分溶解。
試劑六：液體×1瓶，室溫保存。
試劑七：液體×1瓶，4℃保存。
標準液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5mL EP 管，加入10μl標準液，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標準甲醛溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1、除去細胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1 mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。
2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。該待測液需當天使用。
AND活性測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調(diào)節(jié)波長到412 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30min。
3. 對照管：取1支EP管，加入10μL粗酶液，170μL試劑二，10μL試劑三，10μL蒸餾水，混勻后置于37℃
水浴保溫30min；立即加入35μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入100μL上清液，100μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A對照管。
4. 測定管：取1支EP管，加入10μL粗酶液，170μL試劑二，10μL試劑三，10μL試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入35μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取1支新EP管，加入100μL上清液，100μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A測定管。
5. 標準管：取1支EP管，加入100μL標準品，100μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A標準管。
注意：每個樣品都需要做對照管。
AND活性計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位。
AND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品× V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管× 稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T
= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr。
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位。
AND活性(nmol/min/g 鮮重 ) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷(V樣÷V樣總×W)÷T
= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W。
C標準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標準品：500μL=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μL=0.05mL；V樣總：提取液體積，0.5mL；T：催化反應時間（min），30min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位。
AND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管× 稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T
= 45×（A測定管－A對照管）÷ A標準管÷ Cpr。
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位。
AND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷(V樣÷V樣總×W)÷T
= 45×（A測定管－A對照管）÷ A標準管÷W。
C標準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標準品：500μL=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μL=0.05mL；V樣總：提取液體積，0.5 mL；T：催化反應時間（min），30min。
注意事項：
1、粗酶液需在當日完成測定，如需保存，則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油，分裝后，-80℃保存；
2、試劑三和試劑四需臨用前配制，如當天沒有用完，4℃避光保存，可用1周；
3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測定，建議用BCA法測蛋白含量。
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