1.制膠：

先制分離膠，再制濃縮膠，嚴(yán)格按照制膠說(shuō)明書(shū)來(lái)就可以了。需要注意的一點(diǎn)是制膠一定要混勻！混勻！混勻！個(gè)人經(jīng)驗(yàn)是每加一種試劑，就混勻一下，直到最后一種試劑加完。 

對(duì)于初學(xué)者，還要區(qū)分制膠的玻璃板是 1.0cm 還是 1.5cm 的，兩者需要的制膠液體量是不一樣的。另外，玻璃板一定要洗干凈，本人平時(shí)都是用洗潔精洗干凈然后用水沖洗最后用純水沖洗，再放在烤箱里烤干并晾至室溫。 

2.點(diǎn)樣：

點(diǎn)樣的過(guò)程很簡(jiǎn)單，表手抖就 OK 了。再者，點(diǎn)樣的過(guò)程一定迅速，不然前面的樣容易彌散，雖說(shuō)不至于太影響結(jié)果，但對(duì)于有強(qiáng)迫癥的同學(xué)來(lái)說(shuō)還是比較致命的傷害。 

3.跑膠：

注意，跑膠時(shí)也會(huì)出現(xiàn)各種烏龍，如果跑了好大一會(huì)兒還不見(jiàn)條帶下移，請(qǐng)看一下你的玻璃板是否放反；如果跑膠時(shí)發(fā)現(xiàn)溫度過(guò)高，可檢查一下正負(fù)極是否連接反了。跑膠建議恒壓，80V 30min， 120V 60min（這個(gè)得具體看目的條帶的 位置，時(shí)間可相應(yīng)增減） 

4.轉(zhuǎn)膜：

請(qǐng)牢記轉(zhuǎn)膜順序（黑色面-濾紙-海綿-膠-膜-海綿-濾紙-白色面），如若搞不清楚，可想象一下，蛋白質(zhì)是帶負(fù)電荷的，應(yīng)該是往正極方面跑，所以膜應(yīng)該放在正極面。轉(zhuǎn)膜時(shí)要恒流， 285mA—300mA 60min。特別注意的是跑膠時(shí)恒壓，轉(zhuǎn)膜時(shí)恒流這個(gè)條件。 

5.封閉特異性抗原：

封閉和孵育抗體也是非常關(guān)鍵的步驟，封閉建議大家用 5%的脫脂奶粉， 2 個(gè)小時(shí)（或者過(guò)夜），不建議用 BSA。 

6.一抗孵育：

封閉完以后不用洗直接孵育一抗，一抗配置溶液是 3% BSA 的 TBST（注意封閉和抗體孵育用的蛋白，封閉用牛奶，抗體孵育用 BSA，這個(gè)條件是決定條帶是否齊整及有無(wú)雜帶的關(guān)鍵），過(guò)夜（或 2 個(gè)小時(shí)）。時(shí)間上與封閉錯(cuò)開(kāi)，如若封閉過(guò)夜，則一抗只需要兩個(gè)小時(shí)。 

7.二抗孵育：

洗三遍后孵育二抗 1 小時(shí)，洗的時(shí)間很重要，習(xí)慣是洗三遍，第一二三次分別是 5min、10min、15min。還要特別強(qiáng)調(diào)的是，孵育和洗膜用的轉(zhuǎn)速是不一樣的。孵育是低速，使膜和抗體有充分的接觸時(shí)間；洗膜時(shí)要用高速，以使膜洗得干凈。還有，一抗孵育時(shí)正面朝下，封閉和二抗孵育時(shí)都是朝上。（表問(wèn)為什么，不知道，經(jīng)驗(yàn)之談） 

8.曝光：

當(dāng)滿足了所有以上的實(shí)驗(yàn)條件之后，你就可以自信滿滿地去曝光了。相信我，不管是磷酸化的還是普通的蛋白，都會(huì)出現(xiàn)平整光滑的條帶。

最后說(shuō)一下配置實(shí)驗(yàn)所需的各種溶液：TBST 可以買(mǎi)，也可以自己配置；同時(shí) TBST 可以用 PBST 代替，即 PBS 加吐溫就可以了。封閉和抗體孵育時(shí)所用的 5%的脫脂奶粉和 3%的 BSA 都是用 TBST 配置。洗膜時(shí)用 TBST 和 PBST，這個(gè)就不用說(shuō)了吧。