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人外周血白細(xì)胞的分離
正常人外周血白細(xì)胞的分離
一、自然沉降法
正常人外周血紅細(xì)胞與白細(xì)胞的比例約為6000～1000:1，兩類細(xì)胞的沉降速度不同，進(jìn)行正常人外周血白細(xì)胞分離。
1、試劑及配制
1）無Ca2+、Mg2+ Hank’s液。
2）含10%～20% 滅活小牛血清Hank’s液。
2、操作方法
1）取靜脈血2ml，放入加有抗凝劑的試管中，輕輕混勻。
2）將試管直立靜置于室溫或37℃溫箱中30～60min，待紅細(xì)胞自然沉降。此時(shí)可見試管中的懸液分3層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細(xì)胞，在緊貼紅細(xì)胞層上有一呈灰白色的白細(xì)胞層（正常人外周血白細(xì)胞）。
3） 用毛細(xì)管吸取位于紅細(xì)胞層上面的富含白細(xì)胞的細(xì)胞懸液，移入另一試管中；
4） 加入無Ca2+、Mg2+Hank’s液至離試管口3cm處，混勻，以水平離心機(jī)2000r/min 離心10min，棄上清，同法在洗滌兩次。
5）沉淀細(xì)胞用適量10%～20% 滅活小牛血清的Hank’s液重懸，計(jì)數(shù)，配成所需的細(xì)胞濃度的懸液，一般常用2×106/min。
二、加速紅細(xì)胞沉降法
利用高分子量的聚合物促使紅細(xì)胞凝聚成串錢狀，從而加速紅細(xì)胞沉降，使之與白細(xì)胞分離。常用的高分子聚合物有明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及甲基纖維素等。
1、試劑及配制
1）3%明膠（粘度為25泊以上）：選取優(yōu)質(zhì)明膠，用生理鹽水配成3%溶液，置沸水浴加熱溶解，分裝，高壓蒸汽滅菌8磅15～20min。
2）6%右旋糖酐（分子量200～400KD）：用生理鹽水配制。
2、操作方法
1）取抗凝靜脈血加入等量3%明膠鹽水或6%右旋糖酐溶液中，混勻。
2）將試管直立靜置室溫或37℃溫箱中30～60min，利用明膠與紅細(xì)胞的粘合作用，促使紅細(xì)胞快速下沉，而白細(xì)胞留在明膠溶液中。
3）用毛細(xì)吸管吸取富含白細(xì)胞的上層液，移入另一試管中。
4）加入無Ca2+、Mg2+Hank’s液至離試管口3cm處，混勻，以水平離心機(jī)2000r/min 離心10min，棄上清，同法在洗滌兩次。
5）沉淀細(xì)胞用適量10%～20% 滅活小牛血清的Hank’s液重懸，計(jì)數(shù)，配成所需的細(xì)胞濃度的懸液，一般常用2×106/min。
三、正常成人白細(xì)胞正常值
1、白細(xì)胞數(shù)值
成年人外周血液中正常的白細(xì)胞數(shù)值是4～10×10g/L，如果少于4×10g/L為白細(xì)胞減少，超過10×10g/L及為白細(xì)胞增多。
正常值范圍：（單位為×109個(gè)/L）
（1）成人為4.0-10.0
（2）新生兒為15-20
（3）6個(gè)月到2歲為11-12
（4）4到14歲為8
2、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)
在外周血液中可以看到的白細(xì)胞，一般可分：中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等五種。其中以中性粒細(xì)胞最多，其次為淋巴細(xì)胞，其他的白細(xì)胞很少。所謂白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)就是計(jì)算各種白細(xì)胞在它的總數(shù)中所占的百分比數(shù)。
正常值為：中性粒細(xì)胞：50～70%
嗜酸性粒細(xì)胞：0.5～5%
嗜堿性粒細(xì)胞：0～1%
淋巴細(xì)胞：20～40%
單核細(xì)胞：1～8%