上篇寫到原代細(xì)胞的取材，這篇文章說一下原代細(xì)胞的分離制作：
第二節(jié) 原代細(xì)胞的分離和制作
人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長，若需獲取大量細(xì)胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來，常采用的方法如下：
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延長離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因?yàn)?，?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的章節(jié)。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。
（一）機(jī)械分散法
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細(xì)胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡便、快速，但對組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。
（二）消化分離法
組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。
1、酶消化分離法
酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：
（1） 胰蛋白酶分散技術(shù)
胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開，在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對細(xì)胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長短等。
①細(xì)胞類型 胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織,如 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效，但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。
②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過測定而有效，但配制時(shí)必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時(shí)的pH和溫度都要適宜，否則會影響活力，細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān)，最終使用活力為1:200或1:250，56℃pH8.0時(shí)活力最好。
該酶為粉劑，保藏時(shí)要防潮，室內(nèi)溫度不宜過高，保存時(shí)間不能太長，若粉劑結(jié)團(tuán)塊,說明該部分受潮或失效。
③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時(shí)，濃度可適當(dāng)提高，消化時(shí)間適當(dāng)延長。濃度高對細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。
④溫度 一般認(rèn)為胰蛋白酶在56℃時(shí)活性最好，但由于對細(xì)胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃，通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。
⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強(qiáng)分散快，細(xì)胞也容易被消化下來，消化分離細(xì)胞時(shí)PH只能選用7.6～8.0之間，否則對細(xì)胞有損傷。
⑥無機(jī)鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時(shí)，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時(shí)應(yīng)采用無鈣鎂離子的PBS配制。
⑦消化時(shí)間 如果細(xì)胞消化時(shí)間過長，可以損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞的代謝，一般消化時(shí)間為20分鐘為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液，于4℃過夜也可。
分離方法如下：
①過夜冷消化 將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織，再加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過夜，次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2~3次，然后，加入少量營養(yǎng)液吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。
②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：
熱消化多次提取——將剪碎的細(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液，按合適的濃度分瓶培養(yǎng)，然后將留下的未全部消化的組織按上述方法操作，再消化提取細(xì)胞。
冷消化多次提取——方法同上，只是消化溫度為4℃。
先熱消化后冷消化——將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散，制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下過夜，次日再提取細(xì)胞，分散成懸液，分瓶培養(yǎng)。
（2） 膠原酶（Collagenase）消化法
膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡便又可提高細(xì)胞成活率，最終濃度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用緩和，無需機(jī)械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。
經(jīng)過膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細(xì)胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被全部消化開。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長，因此不必要再進(jìn)一步消化處理。
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性（見表4-1）和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)間（小時(shí)）有差異（見表4-2），以及兩者價(jià)格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時(shí)還可加透明質(zhì)酸酶（對細(xì)胞表面糖基有作用），采用兩者的聯(lián)合消化作用，對分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。
表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別
項(xiàng) 目 胰蛋白酶 膠原酶
消化特性 適用于消化軟組織 適用于消化纖維多的組織
用 量 0.01%～0.5% 0.1～0.3mg/mL(200u/mL)
消化時(shí)間 0.5～2小時(shí)（小塊） 1～12小時(shí)
pH 8～9 6.5～7.0
作用強(qiáng)度 強(qiáng)烈 緩和
細(xì)胞影響 時(shí)間過長有影響 無大影響
血清、鈣、鎂離子 有影響 無影響
表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間(小時(shí))(0.5～1cm3)
酶 種 類 較 硬 組 織 軟 組 織
4℃ 室 溫 37℃ 4℃ 室 溫 37℃
胰蛋白酶(0.25%) 24～48 1～6 1～2 12～24 1～2 0.5～1
膠原酶(200u/mL) 24 6 6.5 12 3 0.25
兩者聯(lián)合(對沖) 12～46 12～24 4～12 12～24 6～12 1～2
除上述兩種經(jīng)常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年來，還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細(xì)胞更佳。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離，缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。
消化分離法的操作步驟：
（1）剪切 把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。
（2） 加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜，自然沉降法）。
（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過長。
（4）棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
（5）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗2-3次后，加入全部培養(yǎng)基。
（6）機(jī)械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)如下：
（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
（2）胰蛋白濃度不宜過高，作用時(shí)間不能太長，以避免毒性作用。
（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。
三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法
原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng) 是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的第一次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步，是一項(xiàng)基本技術(shù)。原代細(xì)胞因剛從組織中分離開，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來的遺傳特性，也很接近和反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。
原代細(xì)胞往往有多種細(xì)胞組成，比較混雜，即使從形態(tài)上為同一類型（上皮樣或成纖維樣），但細(xì)胞間仍有很大差異。如果供體不同，即使組織類型、部位相同，個(gè)體差異也照樣存在，原代細(xì)胞生物特性尚不穩(wěn)定，如需做較為嚴(yán)格的對比性實(shí)驗(yàn)研究，還需進(jìn)行短期傳代培養(yǎng)。
1、組織塊培養(yǎng)法
組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法：為將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長，方法簡便，利于培養(yǎng)，部分種類的組織細(xì)胞在小塊貼壁24小時(shí)后細(xì)胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長成肉眼可以觀察到的生長暈，5~7天后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周圍延伸的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實(shí)驗(yàn)研究。
其培養(yǎng)方法如下：
(1)按照前述方法取材，將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤。
(2)將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培養(yǎng)瓶(底面積為17.5cm2)可接種20～30小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使瓶底朝上,然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在37℃溫箱內(nèi)。
(3)培養(yǎng)2~4小時(shí)，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動(dòng)作要輕，嚴(yán)禁搖動(dòng)和來回振蕩，以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時(shí)后再補(bǔ)液，培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長，培養(yǎng)3~5天時(shí)可換液，一方面補(bǔ)充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。
原代細(xì)胞培養(yǎng)－2
2.消化培養(yǎng)法
該方法是采用前述的消化分散法，將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液，然后分瓶培養(yǎng)。
某些特殊類型細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞等的消化手段和步驟，將在有關(guān)章節(jié)中敘述。
3.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法
對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。
4.器官培養(yǎng)
器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，其特性仍保持原有器官細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和聯(lián)系、并能存活，器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細(xì)胞培養(yǎng)不同，但可利用器官培養(yǎng)對器官組織的生長變化進(jìn)行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。體外器官培養(yǎng)為臨床上的organ transplant創(chuàng)造了便利的條件。器官培養(yǎng)的條件與細(xì)胞培養(yǎng)不同，要有特殊的要求。
1. 器官培養(yǎng)的特殊的要求
(1)需要特殊的培養(yǎng)條件 因器官離體培養(yǎng)，其營養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來供給，因此，培養(yǎng)時(shí)為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營養(yǎng)而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過1mm。
(2)器官內(nèi)部細(xì)胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法：
a. 將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換。
b. 提高培養(yǎng)基中的氧分壓，一般需加注純氧，提高氧分壓時(shí)仍需保持5% CO2，以維持pH。
2. 器官培養(yǎng)的方法
(1)將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養(yǎng)皿中，高度為1/2皿高，使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。
(2)將培養(yǎng)基加入平皿中，使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜，但不要使濾膜浮起。
(3)將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上，一般厚度不要超過200μm，水平面積不超過10mm2，如為肝、腎不能大于1mm2。
(4)將培養(yǎng)物置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，并加注氧氣，調(diào)整氧分壓達(dá)90%，培養(yǎng)時(shí)注意使液面與膜保持在一致的水平上。
(5)上述器官培養(yǎng)1~3周（每隔2~3天換液一次）后可用于實(shí)驗(yàn)和檢測。
