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引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺y三酯法。該方法具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應物比較穩(wěn)定的特點。主要是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。
固相亞磷酰胺三酯法合成引物的具體步驟如下：
1) 用三氯-乙酸去除固相載體5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5'-羥基；
2) 將亞磷酰胺保護核苷酸單體與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，與游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應；
3) 由于無法保證*的5'-羥基都參與縮合，可能有極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(少于2%)，可用乙酸酐和1-甲基咪唑試劑將其終止合成，這種短片段可以在純化時分離掉；
4) 在氧化劑的作用下，亞磷酰形式轉變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更穩(wěn)定。
經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸就被連接到固相載體上。重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基連接完成。合成過程中可以監(jiān)控脫下的保護基團DMT的顏色可以初步判定合成效率。