用 途：用于大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中羥脯氨酸(Hyp)測定。
工作原理
本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA) 測定樣品中 大鼠羥脯氨酸(Hyp)水平。向預(yù)先包被了大鼠羥脯氨酸(Hyp)單克隆抗體的酶標(biāo)孔 中加入大鼠羥脯氨酸(Hyp)，溫育；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗 Hyp 抗體。再 與鏈霉親和素-HRP 結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的 酶，然后加入底物 A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色 的深淺與樣品中大鼠羥脯氨酸(Hyp)的濃度呈正相關(guān)。
試劑盒組成
試劑盒組成 | 48 孔配置 | 96 孔配置 | 保存 |
說明書 | 1 份 | 1 份 | |
封板膜 | 2 片 (48) | 2 片 (96) | |
密封袋 | 1 個(gè) | 1 個(gè) | |
酶標(biāo)包被板 | 1 ×48 | 1 ×96 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 80μg/L | 0.5ml×1 瓶 | 0.5ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 3ml×1 瓶 | 6ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
鏈霉親和素-HRP | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
生物素標(biāo)記的抗 Hyp 抗體 | 0.5ml×1 瓶 | 1 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑 A 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑 B 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3ml×1 瓶 | 6ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
濃縮洗滌液 | (20ml×20 倍) × 1 瓶 | (20ml×30 倍) × 1 瓶 | 2-8℃保存 |
需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
3． 精密移液器及一次性吸頭
4． 蒸餾水，
5． 一次性試管
6． 吸水紙
注意事項(xiàng)
1． 從 2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少 30 分鐘。酶標(biāo)包 被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差
3． 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
4． 為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。
5． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
6． 底物 B 對光敏感，避免長時(shí)間暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下 用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少 0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需 要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中
標(biāo)本要求
1．不能檢測含NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的 (HRP) 活性。
2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
操作程序
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋： (本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小
試管中進(jìn)行稀釋。)
40μg/L | 5 號標(biāo)準(zhǔn)品 | 120 μ l 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 120 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
20μg/L | 4 號標(biāo)準(zhǔn)品 | 120 μ l 的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 120 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
10μg/L | 3 號標(biāo)準(zhǔn)品 | 120 μ l 的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 120 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
5μg/L | 2 號標(biāo)準(zhǔn)品 | 120 μ l 的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 120 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
2.5μg/L | 1 號標(biāo)準(zhǔn)品 | 120 μ l 的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 120 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
2. 根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白 孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3. 加樣：1) 空白孔，空白對照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗 Hyp 抗體，鏈霉 親和素-HRP，只加顯色劑 A&B 和終止液，其余各步操作相同；2) 標(biāo)準(zhǔn)品孔： 加入標(biāo)準(zhǔn)品 50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體， 故不加)；3) 代測樣品孔：加入樣本 40ul，然后各加入抗 Hyp 抗體 10ul、 鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育 60 分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后 棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。
6. 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑 B50 μ l，輕輕震蕩混勻，37℃ 避光顯色 15 分鐘.
7. 終止：每孔加終止液 50 μ l，終止反應(yīng) (此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
8. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度 (OD 值) 。 測定應(yīng) 在加終止液后 10 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù) 樣品的OD 值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟 件來計(jì)算。
操作程序總結(jié)：
1.準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
2.加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，生物素標(biāo)記的二抗和酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)60分鐘
3.洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色15分鐘
4.加入終止液
5.10分鐘內(nèi)讀OD值
6.計(jì)算
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.92 以上。
2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和 15%
檢測范圍：
檢測范圍：0-40μg/L。
保存條件及有效期：
保存：2-8℃。
有效期：6 個(gè)月(2-8℃)。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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