RPA(Recombinase Polymerase Amplification)是一種等溫性擴(kuò)增技術(shù)，不需要復(fù)雜的設(shè)備和高溫退火程序。RPA試劑盒中含有DNA引物、解旋酶、聚合酶、寡核苷酸等多種試劑，并且可以特異性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)DNA片段，同時(shí)還可以進(jìn)行多樣本檢測(cè)。在RPA過程中，首先由引物和解旋酶使DNA雙鏈斷裂，然后DNA單鏈與引物特異性結(jié)合，并啟動(dòng)DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過電泳、實(shí)時(shí)熒光和拉曼光譜等方法進(jìn)行檢測(cè)和定量。RPA廣泛應(yīng)用于基因診斷、病原體檢測(cè)、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。

RPA試劑盒的主要組成部分是酶和試劑，其中酶對(duì)溫度比較敏感，所以RPA試劑盒通常不耐高溫。高溫可導(dǎo)致酶的變性和活性損失，影響試劑盒的性能。

RPA試劑盒不耐高溫的主要原因

1. 核酸聚合酶

RPA試劑盒中的核酸聚合酶對(duì)溫度敏感，高溫可導(dǎo)致其構(gòu)象改變，失去活性，無法正常復(fù)制DNA模板。

2. 重組酶Recombinase

RPA試劑盒中的重組酶也對(duì)溫度比較敏感，高溫可破壞其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，失去識(shí)別DNA和催化重組的能力。

3. 單鏈RNA素

RPA試劑盒中的單鏈RNA素結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但也對(duì)溫度敏感，高溫可破壞其結(jié)構(gòu)，失去與核酸的特異性結(jié)合能力。

4. dNTP等

RPA試劑盒中的dNTP和其他試劑在高溫下也更易降解，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5. 酶的協(xié)同作用：

RPA試劑盒中多種酶之間需要協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)DNA的複制和擴(kuò)增，高溫可干擾各酶間的作用，破壞其間的協(xié)同效應(yīng)。