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            初級(jí)會(huì)員 | 第7年

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            超氧陰離子自由基清除能力測(cè)試原理及方法

            時(shí)間:2020/11/3閱讀:12373
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            超氧陰離子自由基清除能力測(cè)試試劑盒

            A002- 192T 酶標(biāo)板法)

            一、 測(cè)定原理

            該方法利用NADH-PMS-NBT為超氧陰離子(O2·-)生成系統(tǒng),超氧陰離子清除劑能減少NBT的藍(lán)色。通過(guò)檢測(cè)560nm處吸光值可判斷體系中還原物質(zhì)的還原能力。

            二、 試劑組成

            試劑一:液體50mL×1瓶;

            試劑二:液體100μL一瓶;

            試劑三:粉劑一支;

            試劑四:粉劑一支;

            試劑五:1mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,100μL。

            三、 儲(chǔ)存條件及有效期

            試劑盒-20℃可保存3個(gè)月。

            四、 試劑的配制

            試劑二工作液:加入10mL試劑一,充分搖勻,現(xiàn)配現(xiàn)用,注意避光;

            試劑三工作液:加入10mL試劑一,充分搖勻,現(xiàn)配現(xiàn)用,配好后冰上保存,2h內(nèi)使用;

            試劑四工作液:用50mL雙蒸水溶解,搖勻后,取1mL,加入9mL試劑一,現(xiàn)配現(xiàn)用,注意避光,配好的試劑請(qǐng)于2小時(shí)內(nèi)用完。

            試劑五:陽(yáng)性對(duì)照,按需使用,-20℃保存。

            五、 操作步驟

             

            空白孔1

            測(cè)定孔

            對(duì)照孔2

            試劑一(μL

            50

             

            50

            試劑二工作液(μL

            50

            50

            50

            試劑三工作液(μL

            50

            50

             

            樣品(μL

             

            50

            50

            充分混勻

            試劑四工作液(μL

            50

            50

            50

            充分混勻,室溫避光靜置5min使之充分反應(yīng)。560nm處采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值。

            1空白管很重要,建議做3個(gè)以上平行;

            2如樣品顏色較淺可不做對(duì)照管

            六、計(jì)算公式

             

            注: 1 如未做對(duì)照孔,可以將其視作為0;

            2 陽(yáng)性對(duì)照求值時(shí)將其視作測(cè)定孔進(jìn)行計(jì)算即可。

            七、注意事項(xiàng)

            1. 如樣品中色素物質(zhì)不是分析對(duì)象,建議先通過(guò)SEP C18柱進(jìn)行脫色處理,處理后樣品可不做對(duì)照孔;

            2. 如不確定樣品的超氧陰離子自由基清除能力,可先做不同濃度的稀釋液進(jìn)行摸索,并選擇適宜濃度進(jìn)行測(cè)定,高濃度下,濃度與清除率間并不線(xiàn)性相關(guān)。

            3. 試劑二、三切記全程低溫操作,尤其試劑三,長(zhǎng)時(shí)間室溫放置或反復(fù)凍融會(huì)使其失效。試劑四切記避光保存,特別是配制后,需用鋁箔紙包裹,且應(yīng)盡快用完。建議在做好一切其它準(zhǔn)備工作后再配制試劑四應(yīng)用液。試劑四正常顏色為黃色,強(qiáng)光照射下,5-10分鐘內(nèi)會(huì)變?yōu)榫G色,隨后變?yōu)樗{(lán)色,變色后試劑不可再用!

            4. 試劑二、三應(yīng)用液和樣品混勻后再加入試劑四,次序顛倒會(huì)導(dǎo)致不顯色。

            5. 部分物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致顯色加深,導(dǎo)致求得的抑制率是負(fù)值,如遇到此類(lèi)現(xiàn)象請(qǐng)先確定該物質(zhì)是否具有超氧陰離子清除能力,再考慮更換方法,如鄰苯三酚自氧化法等進(jìn)行測(cè)試。

             

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