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人免疫球蛋白G糖基化的高靈敏度高重現(xiàn)性分析
閱讀：781 發(fā)布時間：2022-8-31前言作為一大類新型藥物，抗體代表了重組產(chǎn)生的治療性蛋白中最大的一類。這些治療劑的療效與其糖基化模式正確與否高度相關，迄今為止，所有獲得許可的治療性單克隆抗體 (mAb) 均是免疫球蛋白 G (IgG)1。因此，糖基化模式分析是質量保證/質量控制 (QA/QC) 過程的一個重要部分。此外，患者血漿中 IgG 的糖基化模式可以反映其健康狀態(tài)2。人 IgG含有一個保守的 N-連接糖基化位點，它位于每條重鏈 Fc 區(qū)的 Asn-297 位3。這使得每個 IgG 分子含有高度異質性的兩個糖基，并會產(chǎn)生至少 30 種糖型的混合物1。血漿中的人 IgG N-連接多糖主要為二天線復合型結構，大多數(shù)包括核心巖藻糖并具有 0-2 個半乳糖殘基和 1-2 個唾液酸。此外，人 IgG 還攜帶有少量的二等分 N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc) 殘基。一般而言，缺失非巖藻糖化或二等分 GlcNAc多糖結構，基本不會降低重組單克隆抗體(mAbs) 的模式復雜性4。同時，還發(fā)現(xiàn)了其他更多未成熟結構，例如像 mannose-5一樣的高甘露糖型結構，雖然它們的量大都較低5。
蛋白糖基化模式的分析挑戰(zhàn)性，特別是因為復雜生物樣品中多糖分析物的豐度常常很低。利用親水相互作用色譜(HILIC)-HPLC 結合熒光檢測器分離 AB 標記的多糖結構是一種穩(wěn)定、靈敏的多糖分析方法6。在本應用簡報中，我們使用了這種方法并檢驗了其精密度、線性和靈敏度。圖 1 顯示了本應用簡報中所用的多糖結構、亞型及命名，它們也曾用于之前的出版物中7。根據(jù)所連的末端半乳糖殘基數(shù)量，將與 IgG 連接的多糖劃分成不同的亞型，如圖 1b 所示。G0、G1 和 G2 分別含有 0、1 和 2 個末端半乳糖殘基。
實驗部分實驗中所用的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)包括以下模塊：• Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵(G5611A)• Agilent 1260 Infinity 高性能生物惰性自動進樣器 (G5667A)• Agilent 1290 Infinity 自動進樣器控溫器 (G1330B)• Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (G1316C)• Agilent 1260 Infinity 二極管陣列檢測器 VL (G1315D)，配有生物惰性標準流通池，10 mm• Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器(G1312B)，配有生物惰性 FLD 流通池色譜柱TOSOH TSK-GEL Amide-80 色譜柱，2 ×150 mm，3 µm軟件Agilent OpenLAB CDS，用于 LC 及 LC/MS 系統(tǒng)的 ChemStation 版本，Rev.C.01.02 [14]溶劑及樣品緩沖液 A：100 mM 甲酸銨溶液，pH 4.5緩沖液 B：乙腈
多糖標準品• GLYKO2-AB（- 人IgGN-連接多糖文庫），200 pmol• GLYKO 2-AB-(MAN-5) & Man5，100 pmol• GLYKO 2-AB-(NA2) & G2，100 pmol• GLYKO 2-AB(A1) & G2S1，100 pmol• GLYKO 2-AB-(A1F) & G2FS1，100 pmol• GLYKO 2-AB-(A2) & G2S2，100 pmo
所有的多糖標準品均溶于 50 µL 100 mM的甲酸銨溶液，pH 值為 4.5。所有的溶劑均為 LC 級。超純水由配有0.22 µm 使用點折疊膜濾芯 (Millipak) 的Milli-Q Integral 系統(tǒng)現(xiàn)制。甲酸銨購自西格瑪奧德里奇公司（美國圣路易斯）。AB 標記的多糖標準品購自 Prozyme 公司（美國海沃德）。
結果與討論AB 標記的人 IgG 標準品 N-多糖的可重現(xiàn)分析圖 2 為 AB 標記的人 IgG N-連接多糖文庫的色譜分離圖。存在于人 IgG 中的所有主要的多糖結構均得到了很好的分離。對于峰標記，采用多種文獻中的命名法 3, 8, 9。所有主要的多糖均核心巖藻糖化，具有 0、1 或 2個半乳糖基化結構，具體見表 1。除了單唾液酸化的 G2FS1（最后一個峰）之外，所有的多糖均為中性結構。
使用人 IgG N-連接多糖文庫，我們測定了 5 次連續(xù)進樣的保留時間和峰面積的精密度。所有多糖結構的保留時間精密度均低于 0.16%，峰面積精密度在 0.66% 到4.11% 之間，具體見表 2。所有測得的保留時間和峰面積的 RSD 值均在通常報道的范圍內10。線性將 5 種多糖標準品（Man5、G2、G2S1、G2FS1 及 G2S2）的混合物按 1:3 比例連續(xù)稀釋，得到 0.008 至 1 pmol 的濃度范圍，然后計算線性。圖 3 為 5 種 N-多糖混合物的色譜分離圖，其中柱上樣量為1 pmol。
信噪比 (S/N) 為 3 時，檢測限 (LOD) 在 10到 15 fmol 之間。信噪比 (S/N) 為 10 時，定量限 (LOQ) 在 34 到 51 fmol 之間。所有校正曲線均具有良好的線性，相關系數(shù)均大于 0.999，具體見表 3。FLD 檢測器的光電倍增管 (PMT) 增益設為 14 以提高靈敏度。此外，使用 Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器分析多達 4 種不同的激發(fā)和發(fā)射波長時，需要對方法進行優(yōu)化，最終設置激發(fā)波長為260 nm，發(fā)射波長為 430 nm。這種組合波長相比多糖分析中常用的波長（例如Anumula 200511 中所推薦的）所得的峰強度要高得多。
結論本應用簡報證實了對于AB 標記的人 IgGN-連接多糖，配有熒光檢測器的 Agilent1260 Infinity 生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)是實現(xiàn)其高靈敏度高重現(xiàn)性 HPLC 分析的理想系統(tǒng)。人 IgG N-連接多糖文庫的分析表明，所有主要的多糖結構均得到了良好的分離。保留時間精密度低于 0.16%，峰面積精密度在 0.66% 和 4.11% 之間。所有測得的保留時間和峰面積的 RSD 值均在通常報道的范圍內10。根據(jù) Campbell 等人12 提出的結構指認軟件可知，保留時間的高精密度對于正確指認多糖結構具有極其重要的意義。
5 種多糖標準品（Man5、G2、G2S1、G2FS1 及 G2S2）的混合物按 1:3 的比例連續(xù)稀釋，得到 0.008 至 1 pmol 的濃度范圍，然后計算線性。所有校正曲線均具有良好的線性，相關系數(shù)均大于 0.999。檢測限 (LOD) 在 10 到 15 fmol 之間，定量限 (LOQ) 在 34 到 51 fmol 之間。優(yōu)化 Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器的熒光波長后，峰強度更高，并因此使所得的信噪比更佳。其中，激發(fā)波長并沒有使用 330 nm（由 Anumula 200512 推薦），而是使用了更低的 260 nm。配有熒光檢測器的 Agilent 1260 Infinity生物惰性四元液相色譜系統(tǒng)是對 2-AB 衍生的 N-連接多糖進行高靈敏度高重現(xiàn)性HPLC 分析的*佳系統(tǒng)。