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大家都了解液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對膠類藥材進(jìn)行鑒定
閱讀：1185 發(fā)布時間：2022-1-19摘要：本文基于 2015 年版《中國藥典》[1] 中采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析膠類藥材的定性方法，開 發(fā)了穩(wěn)定、快速、靈敏的三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用 法和四極桿飛行時間液質(zhì)聯(lián)用 (LC/Q-TOF) 法進(jìn)行阿膠、鹿角膠、龜甲膠的定性鑒別；同時，利用 Q-TOF 強大的化合物 定性能力，結(jié)合蛋白質(zhì)庫，建立了特征肽段序列分析方法以及“假藥”的初步定性方法。
前言：膠類藥材是我國傳統(tǒng)中藥中一類特殊的動物藥，是由動物的皮、骨骼等經(jīng)特殊工藝加工 而成，常見的有阿膠、鹿角膠、龜甲膠及其相關(guān)中成藥制劑。近年來，隨著膠類藥用量 增長，原料資源供不應(yīng)求，新聞曝光了一些不法生產(chǎn)企業(yè)為降低成本，采用其它動物雜 皮投料，給消費者的健康帶來嚴(yán)重隱患。為了保障公眾用藥安全有效，2015 年版《中國 藥典》[1] 制訂了符合膠類藥材特點的定性方法：采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，分析阿膠、鹿角膠、 龜甲膠的特征肽段，方法專屬性強、科學(xué)可靠。 安捷倫科技公司針對這一變化開發(fā)了穩(wěn)定、快速、靈敏的三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用法，進(jìn)行阿膠、鹿角膠、龜甲膠的定性鑒別。同時，鑒于很多實驗室有高分辨質(zhì)譜測試 需求，我們在藥典 液質(zhì)聯(lián)用方法的基礎(chǔ)上，開發(fā)了四極桿飛行時間液質(zhì)聯(lián)用 (LC/Q-TOF) 法。此外，利用 Q-TOF 強大的化合物定性能力，結(jié)合蛋白質(zhì)庫，建立了特征肽段序列分 析方法以及“假藥”的初步定性方法。
實驗部分：試劑和樣品材料 實驗用色譜純乙腈購自 Merck，色譜純甲酸購自 Dikma，超純 水為 Milli-Q 系統(tǒng)制備，碳酸氫銨購自 ACROS，胰蛋白酶購自 Promega。樣品材料為市售阿膠、鹿角膠、龜甲膠。 儀器 Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色譜 Agilent 6460C 三重四極桿質(zhì)譜儀 Agilent 6530 四極桿飛行時間質(zhì)譜儀
樣品制備 取樣品粉末 0.01 g，加 1% 碳酸氫銨溶液 5 mL，超聲處理 30 分 鐘后，用 0.22 uM 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液 100 μL 置微量進(jìn)樣瓶 中，加胰蛋白酶溶液 10 μL（采用序列分析用胰蛋白酶，加 1% 碳 酸氫銨溶液制成每 1 mL 中含 1 mg 胰蛋白酶的溶液，臨用時配制）， 搖勻，37 °C 恒溫酶解 12 小時。
色譜條件 色譜柱： Eclipse Plus C18（2.1 x 100 mm，1.8 μm） 柱溫： 40 °C 進(jìn)樣體積： 5 µL 流速： 0.3 mL/min 流動相： A：H2O 含 0.1% 甲酸；B：乙腈 梯度洗脫： 0 min 5%B；25 min 20%B；40 min 50%B 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜條件 質(zhì)譜系統(tǒng)： Agilent 6460C 離子源： 配備安捷倫噴射流的 ESI 模式： 正離子 霧化氣： N2 霧化氣壓力： 30.0 psi 干燥氣溫度： 325 °C 干燥氣流量： 8.0 L/min 毛細(xì)管電壓： 3500 V 鞘氣溫度： 350 °C 鞘氣流量： 12.0 L/min 噴嘴電壓： 0 V Delta EMV： 0 V 掃描模式： MRM 表 1 中列出了與待測物相關(guān)的 MS MRM 參數(shù)
四極桿飛行時間質(zhì)譜條件 質(zhì)譜系統(tǒng)： Agilent 6530 離子源： 配備安捷倫噴射流的 ESI 模式： 正離子 霧化氣： N2 霧化氣壓力： 30.0 psi 干燥氣溫度： 325 °C 干燥氣流量： 8.0 L/min 毛細(xì)管電壓： 3500 V 鞘氣溫度： 350 °C 鞘氣流量： 12.0 L/min 噴嘴電壓： 0 V 掃描速度： 3 譜圖/秒 掃描模式： 鑒定采用 Target MS/MS， 未知肽段定性采用 Auto MS/MS 表 2 中列出了與待測物相關(guān)的目標(biāo)質(zhì)量數(shù)
結(jié)果與討論 基于 2015 年版《中國藥典》開發(fā)的 液質(zhì)聯(lián)用法分析膠類藥材，重現(xiàn)性好、靈敏度高。阿膠、鹿角膠、龜甲膠各 MRM 通道信噪比均大于 500，其中龜甲膠的 631.3→546.4 通道信噪比大于 77000（如圖 1 所示），能夠滿足 2015 年版 《中國藥典》信噪比大于 3:1 的要求。
采用 LC/Q-TOF 法分析膠類藥物時，利用 Target MS/MS 模式采集數(shù)據(jù)，運用高分辨 EIC 碎片離子提取技術(shù)進(jìn) 行數(shù)據(jù)處理，可以獲得與液質(zhì)聯(lián)用法一致的定性結(jié)果。阿膠、鹿角膠、龜甲膠各特征離子信噪比均大于 200，同 樣滿足 2015 年版《中國藥典》信噪比大于 3:1 的要求。圖 2 為采用 LC/Q-TOF 法分析龜甲膠所得特征碎片 離子色譜圖。
此外，Q-TOF 可以提供可靠的 MS 和 MS/MS 數(shù)據(jù)，其具有強大的化合物定性能力，結(jié)合蛋白質(zhì)庫，可以進(jìn)行特 征肽段的序列分析。圖 4 和圖 5 展示了阿膠中上述特征肽段 m/z 618.3 二級質(zhì)譜圖及其序列分析結(jié)果。該特征 肽段位于驢的 I 型膠原蛋白 α2 鏈上第 692 – 706 位置上，氨基酸序列為 G-E-A-G-A-A-G-P-A-G-P-A-G-P-R。
結(jié)論 分別采用 Agilent 6400 系列液質(zhì)聯(lián)用和 6500 系列 Q-TOF 液質(zhì)聯(lián)用 系統(tǒng)，針對 2015 版藥典收載的阿膠、龜甲膠、鹿角膠三種膠類 藥材進(jìn)行定性方法開發(fā)，結(jié)果表明，阿膠、龜甲膠、鹿角膠的信 噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于藥典的要求。在此基礎(chǔ)上，開發(fā)了膠類藥品的專屬 性肽段鑒別方法以及特征肽段序列分析方法，并將特征肽段分析 成功應(yīng)用于一例“假龜甲膠”的鑒別中