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通過LC/MS 在低pH及高 pH下分析濫用藥物
閱讀：652 發(fā)布時間：2022-1-5前言：本應用簡報使用正離子電噴霧模式 (ESI+) 與一般梯度，對高 pH 和 低 pH 條件下的 LC/MS 分析幾種濫用藥物相關化合物進行了對比。人們通常認為分析物分子的離子化狀態(tài)將取 決于流動相的 pH，使用高 pH 流動相時，LC/MS 在正離子電噴霧模式下的離子化效率將 顯著降低，因為此時化合物呈中性。然而，許多研究人員對不同類型的樣品（包括蛋白 質、多肽和氨基酸）進行研究后發(fā)現(xiàn)，離子化效率對流動相 pH 的增加不敏感，靈敏度甚 至還有所提高 [1-6]。在 ESI+ 模式下，高 pH 流動相并不會抑制堿性化合物的離子化； 相反會形成大量正離子，而且在高 pH 條件下得到的分析物響應通常比低 pH 酸性流動相 下的響應更高。這一發(fā)現(xiàn)非常重要，因為它將普通洗脫方法的適用性擴展至此前難以保 留的極性堿性化合物的分析。 然而結果表明，許多可在高 pH 下使用的條件會損壞傳統(tǒng)的硅膠 HPLC 色譜柱。使用 Agilent Poroshell HPH C18 等可在高 pH 條件下保持穩(wěn)定的新型色譜柱，無需犧牲色譜 柱使用壽命即可通過控制 pH 來調整選擇性和靈敏度。色譜工作者可通過這些色譜柱在方 法開發(fā)中采用表面多孔顆粒技術探索更寬的 pH 范圍，表面多孔顆粒技術以其高效和快速 的特點得到了越來越多的應用 [7]。
實驗部分：實驗采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜與 Agilent 6460 三重四極桿質譜儀的聯(lián)用系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括： • Agilent 1290 Infinity 二元泵，耐壓高達 1200 bar (G4220A)， 通過在溶劑旁路閥中采用 PEEK 密封墊進行改良（PEEK FL 轉子密封墊部件號 5068-0171） • Agilent 1290 Infinity 柱溫箱 (TCC) (G1316C) • Agilent 1290 Infinity 高性能自動進樣器 (G4226A)，配備 PEEK 轉子密封墊（PEEK FL 轉子密封墊部件號 5068-0170） • Agilent Poroshell HPH C18, 3 × 100 mm, 4 µm
PEEK FL 密封墊應與碳酸氫銨緩沖液配套使用。Agilent 1290 系列儀器中的標準轉子密封墊由 Vespel 制成，僅支持有限的 pH 范 圍 (1 - 10)。PEEK FL 轉子密封墊則由特殊的 PEEK 混合材料制成， 適用于更寬的 pH 范圍 (1.0 - 12.5)。將 UHPLC 安裝在 A-line 機架 上。該系統(tǒng)采用 0.075 µm 管線連接以最大限度減少擴散。這將產(chǎn) 生高于傳統(tǒng) 0.12 mm 或 0.17 mm 內(nèi)徑管線的反壓，但這并不會產(chǎn) 生問題，因為 4 µm Poroshell HPH C18 柱產(chǎn)生的反壓極小。表 1 列出了 MRM 離子對與監(jiān)測離子。 將甲酸銨和甲酸配制為 5 mM 的溶液，并用其配制 pH 為 3 的低 pH 緩沖液。甲酸銨購自 Sigma-Aldrich 公司，二次蒸餾甲酸購自 GFS。利用碳酸氫銨和氫氧化銨配制 pH 為 10.5 的緩沖液，這兩 種化合物均由 Sigma-Aldrich 提供。
結果與討論 在本應用簡報中，對以上化合物在堿性流動相和酸性流動相中的 洗脫行為進行比較，結果發(fā)現(xiàn)堿類在堿性流動相中的保留時間更 長。堿性化合物被*質子化，在反相 HPLC 中的保留特性優(yōu)于 帶電化合物。由于這些化合物具有更出色的保留特性，因此可進 行更多的溶劑調節(jié)以獲得峰間距，如圖 1 所示。梯度和 流動相條件如圖 1 中所述?？偟膩碚f，某些分析物在堿性溶劑中 比在酸性流動相中具有更大的色譜峰。與曲唑酮、維拉帕米、普羅地芬相關的峰在堿性流動相中明顯增大。這可能是由 于 pH 的影響，但也可能是由于化合物保留時間較長以及采用更 強的有機流動相進行洗脫。
結論 此前的研究表明，Agilent Poroshell HPH-C18 能夠在高 pH 流動 相（例如 pH 為 10 的碳酸氫銨緩沖液）中長時間使用（進樣 2000 次以上）。因此，色譜工作者如今可在方法開發(fā)中采用表面 多孔顆粒技術探索更寬的 pH 范圍，而表面多孔顆粒技術也以其 高效和快速的特點得到了越來越多的應用。高 pH 流動相與表面 多孔顆粒的配合使用既有益又實用 [8]。