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檢測(cè)眼用藥中的可萃取物與可浸出物-高分辨率LC/MS
閱讀：636 發(fā)布時(shí)間：2021-12-23摘要 從容器封閉系統(tǒng)中浸出的化合物會(huì)對(duì)藥品的原料藥和產(chǎn)品造成污染。為了完 善風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，有必要鑒定這些化合物并確保藥物適合其預(yù)期用途。通常來 說，這些化合物濃度很低，并且會(huì)被藥物基質(zhì)掩蓋。因此，需要高度靈敏和 高選擇性的方法來檢測(cè)和鑒定這些化合物。四極桿飛行時(shí)間 (Q-TOF) 質(zhì)譜儀 具有*的分辨率和精確質(zhì)量數(shù)測(cè)量能力，非常適合檢測(cè)此類物質(zhì)。Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)聯(lián)用 Agilent 6540 Q-TOF 系統(tǒng)再加上統(tǒng)計(jì)分析軟件， 可以準(zhǔn)確檢測(cè)和鑒定眼用藥中的可萃取和可浸出 (E&L) 雜質(zhì)。使用 Agilent Mass Profiler 軟件 (MP) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，以確定與對(duì)照品相比，樣品中存 在的化合物。MP 軟件的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索工具有助于使用自定義的精確質(zhì)量數(shù)據(jù) 庫(kù)鑒定 E&L。為了鑒定未知的 E&L，本研究通過 MS/MS 數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟 件（分子結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)軟件）進(jìn)行分析。在本研究中，每個(gè) E&L 樣品中檢測(cè)到 50 種化合物。
前言 藥品的原料藥和產(chǎn)品可能會(huì)受到一級(jí) 和二級(jí)包裝材料中的化合物的污染。 可從容器封閉系統(tǒng)中直接萃取的化合 物稱為可萃取物，而在制劑中發(fā)現(xiàn)的 化合物則稱為可浸出物，通常屬于可 萃取物中的子集。這些雜質(zhì)的存在可 能會(huì)影響消費(fèi)者健康，因此美國(guó)食品 藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 發(fā)布了人用藥 品和生物制品包裝用容器封閉系統(tǒng)指 導(dǎo)原則1 。該指導(dǎo)闡述了保護(hù)性、安全 性和相容性方面的規(guī)定。一般來說， 可萃取物和可浸出物 (E&L) 的分析相 當(dāng)復(fù)雜，主要是以下幾個(gè)原因： • 制造一級(jí)和二級(jí)容器所用的材 料多種多樣 • 萃取或浸出的雜質(zhì)的理化特性 差異巨大 • 在不同樣品中的濃度范圍相差 較大（從 pg/mL 到 µg/mL） • 需要對(duì)廣闊范圍內(nèi)不同基質(zhì)中 的這些化合物進(jìn)行檢測(cè) 為克服這些挑戰(zhàn)，需要采用多種分析 技術(shù)，通常是互補(bǔ)的分析技術(shù)，如 LC/MS液質(zhì)聯(lián)用儀、GC/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀 和 ICP/MS。最近發(fā)表 的應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)已經(jīng)證明了 GC/MS2,3,4 方法 的高效性。此外，Norwood 等人概括 了大量用于分析 E&L 的 LC 和 LC/MS 方法5 。
在篩查雜質(zhì)的過程中，空白溶劑中也 可能含有源自容器的 E&L。如果在數(shù) 據(jù)處理過程中，使用簡(jiǎn)單的背景扣 除法將空白溶劑中的化合物從樣品中 去除，也會(huì)導(dǎo)致樣本中原本可能存在 的 E&L 被去除了。因此，有必要進(jìn)行 樣品間的比較，根據(jù)化合物的強(qiáng)度變 化來保留目標(biāo)化合物。Agilent Mass Profiler (MP) 是一種統(tǒng)計(jì)程序，能夠比 較數(shù)據(jù)集之間的相似和差異。這些數(shù) 據(jù)集可以是兩個(gè)單獨(dú)的樣品、單個(gè)樣 品的重復(fù)測(cè)定，或者兩個(gè)樣品組的重 復(fù)測(cè)定。化合物鑒定是非目標(biāo)性分析 的一部分，結(jié)合了高分辨率質(zhì)譜的數(shù) 據(jù)庫(kù)搜索和分子式生成功能。
在本研究中，使用配有 Agilent 6540 Q-TOF 質(zhì)譜儀的 Agilent 1290 Infinity UHPLC 系統(tǒng)對(duì) E&L 進(jìn)行分離、檢測(cè)和 鑒定。Agilent MP 與（用戶生成的） 自定義 E&L 數(shù)據(jù)庫(kù)共同使用。無論是 已知還是未知化合物，安捷倫分子結(jié) 構(gòu)關(guān)聯(lián) (MSC) 軟件都能將 MS/MS 譜 圖與理論上的最佳結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配。 圖 1 顯示了用于眼用藥 (ODP) 中 E&L 的分析方法。該方法能夠快速且準(zhǔn)確 地鑒定可萃取物和可浸出物。
實(shí)驗(yàn)部分 表 1 列出了用于創(chuàng)建個(gè)人化合物數(shù) 據(jù)庫(kù)的化合物。它們均購(gòu)自 SigmaAldrich。本研究中使用了 MS 級(jí)甲醇 和去離子水 (Milli-Q, Millipore)。 樣品前處理 可萃取樣品 眼藥瓶從印度當(dāng)?shù)氐纳痰曩?gòu)買。用水 洗滌眼藥瓶，裝滿萃取溶劑（1:1 的甲 醇:水），然后在烘箱中 55 °C 下溫育 72 h。將萃取物直接進(jìn)樣到 LC/MS/MS 系統(tǒng)中。將含有純的萃取溶劑的第二 樣品作為空白對(duì)照進(jìn)行分析。
可浸出樣品 將眼用藥制劑及其容器在 60 °C 下加 熱 24 h，得到第一可浸出樣品，稱為 處理樣品。將加熱后的制劑直接進(jìn)樣 到 LC/MS/MS 系統(tǒng)中。在推薦條件 下儲(chǔ)存的眼用藥制劑是第二可浸出樣 品，稱為未處理樣品，也直接進(jìn)樣到 系統(tǒng)中。 所有樣品進(jìn)行三次重復(fù)分析。 儀器設(shè)置 使用 Agilent 1290 Infinity 二元液相色 譜系統(tǒng)和配有雙安捷倫噴射流離子 源的 Agilent Q-TOF G6540A 系統(tǒng)進(jìn)行 LC/MS/MS 分析。Agilent 1290 Infinity 二元 UHPLC 系統(tǒng)包括： • Agilent 1290 Infinity 二元泵（部 件號(hào) G4220A） • Agilent 1290 Infinity ALS 恒溫器 （部件號(hào) G4226A） • Agilent 1290 Infinity ALS 恒溫器 （部件號(hào) G1330B） • Agilent 1260 Infinity 柱溫箱（部 件號(hào) G1316A）
表 1 顯示了這些分析所用的 LC 和 MS 條件。離子源條件經(jīng)過優(yōu)化，可以實(shí) 現(xiàn) E&L 的高靈敏度檢測(cè)。在正離子化 和負(fù)離子化模式下進(jìn)行 LC/MS 分析。 數(shù)據(jù)分析 使用以下軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析： • Agilent MassHunter 數(shù)據(jù)采集軟 件 B.06.01 • Agilent MassHunter 定性分析軟 件 B.07.00• Agilent MassHunter PCDL Manager B.07.00 • Agilent MassHunter Mass Profiler B.07.01 • Agilent MassHunter Profinder B.06.00 • Agilent MassHunter 分子結(jié)構(gòu)關(guān) 聯(lián)軟件 B.07.00
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結(jié)論 本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)表明，Agilent 1290 Infinity UHPLC 系統(tǒng)與 Agilent 6540 Q-TOF 聯(lián)用 可用于分析眼用藥及其容器中的 E&L 化合物。采用包含兩個(gè)步驟的工作流 程可對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治?。第一?是使用 Agilent Mass Profiler 軟件進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)對(duì)比以區(qū)分 E&L 化合物與對(duì)照樣 品。使用精確質(zhì)量數(shù) PCDL 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒 定樣品間存在顯著差異的化合物。在 第二步中，使用 MSC 軟件對(duì)已知化 合物和未知化合物進(jìn)行分析。這樣可 以有效確認(rèn)已知化合物，還有利于未 知化合物的結(jié)構(gòu)解析。研究發(fā)現(xiàn)每個(gè) E&L 樣品中大約存在 50 種化合物。 這項(xiàng)研究結(jié)果鑒定了可能構(gòu)成潛在健 康風(fēng)險(xiǎn)的多種化合物?？山鑫镅芯?的半定量結(jié)果顯示了三種化合物：鄰 苯二甲酸二異壬酯、鄰苯二甲酸二辛 酯和芥酸酰胺，它們可在脅迫處理樣 本中可浸出到藥品中，并且濃度超過 1 μg/mL，因此應(yīng)向監(jiān)管機(jī)構(gòu)報(bào)告。