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前言：單克隆抗體 (mAb) 因其對人類健康的治療價值而得到了大量關(guān)注1 。生物仿制藥 是特定疾病創(chuàng)新藥物 mAb 的復(fù)制品，這類仿制藥物 迅速擴(kuò)大了市場2 。一些用于研究蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性3 以及證明創(chuàng)新藥物和生物仿 制藥之間相似性的方法包括紫外光譜、圓二色性光譜和熒光光譜4 。本應(yīng)用簡報 采用 Agilent Cary 60 紫外-可見分光光度計對一種創(chuàng)新藥物（利妥昔單抗）及其生 物仿制藥進(jìn)行了分析。隨后利用專用的 WinUV 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行了解析，并采用 二階導(dǎo)數(shù)吸收光譜進(jìn)行了詳細(xì)的比較。結(jié)果不僅突出了 Cary 60 作為此應(yīng)用分析 解決方案的固有功能，還證明了收集的數(shù)據(jù)如何提供蛋白質(zhì)球狀結(jié)構(gòu)中芳香族 氨基酸的微環(huán)境信息，從而證明了 mAb 在不同測試條件下的穩(wěn)定性。

紫外-可見光譜的優(yōu)勢 紫外-可見光譜是一種成熟可靠的技 術(shù)，能夠深入了解蛋白質(zhì)的總體結(jié) 構(gòu)。它應(yīng)用廣泛，不需要昂貴的試劑 或消耗品。重要的是，紫外-可見光譜 法也是非破壞性的，因此測量的樣品 可以回收。在采用液相色譜或質(zhì)譜等 技術(shù)進(jìn)一步分析之前，這一關(guān)鍵屬性 使紫外-可見光譜法成為一種理想的正 交工具。 Cary 60 紫外-可見分光光度計是一種穩(wěn) 定且高效的分析工具?；陂W爍式氙 燈的光學(xué)設(shè)計具有*功能，可避免 樣品發(fā)生光降解；而且省去了儀器預(yù) 熱時間，有助于提高分析效率。這些 特性確保 Cary 60 紫外-可見分光光度 計常規(guī)應(yīng)用于各種領(lǐng)域，并能獲得準(zhǔn) 確、精密、可重復(fù)的數(shù)據(jù)。

材料與方法 L-苯丙氨酸、L-色氨酸和 L-酪氨酸來自 安捷倫科技公司。利妥昔單抗創(chuàng)新藥 物和生物仿制藥購自當(dāng)?shù)匾患宜幍辍?其他所有化學(xué)品購自 Sigma-Aldrich。 樣品前處理 使用 Tris HCl 緩沖液 (pH 6.0) 配制抗體， 濃度為 500 mg/mL。鹽酸胍 (GdnHCl) 用于誘導(dǎo) mAb 變性，其濃度范圍為 0-6 M。將適量蛋白儲備液 (10 mg/mL) 和含 0-6 M GdnHCl 的 Tris HCl 緩沖液 (pH 6.0) 混合制得樣品。L-苯丙氨酸、 L-色氨酸和 L-酪氨酸用水配制。 吸光度測量和數(shù)據(jù)分析 Cary 60 紫外-可見分光光度計可獲得高 分辨吸收光譜。所有樣品在室溫下進(jìn) 行分析，石英比色皿規(guī)格為 3 mL，光 程為 1 cm。在 240-350 nm 的波長范圍 內(nèi)，每隔 0.5 nm 采集光譜。 在 Cary WinUV 軟件應(yīng)用中，采用五點 數(shù)據(jù)過濾的 Savitzky Golay 算法計算得 到二階導(dǎo)數(shù)光譜。在每個原始數(shù)據(jù)點 之間采用 99 個插入點，所得的導(dǎo)數(shù)光 譜中應(yīng)用一種樣條函數(shù)，將分辨率提 高至 0.01 nm，以監(jiān)測 GdnHCl 誘導(dǎo)的 抗體伸展。

結(jié)果與討論 二階導(dǎo)數(shù)吸收光譜有助于分析色氨 酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基（分別為 W、Y 和 F）的微環(huán)境，這三種殘基 是反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一項指標(biāo)5,6。當(dāng) 蛋白質(zhì)從有序變?yōu)闊o序狀態(tài)時，二階 導(dǎo)數(shù)光譜解決芳香族氨基酸譜帶的能 力可以監(jiān)測吸光度的特定偏移。圖 1 顯示了除單克隆抗體之外的游離 L-芳 香族氨基酸的掃描光譜和相應(yīng)的二階 導(dǎo)數(shù)光譜。查看每個二階導(dǎo)數(shù)吸收光 譜時，這些氨基酸和蛋白質(zhì)的特點可 以清晰地顯現(xiàn)出來。二階導(dǎo)數(shù)光譜中 291 nm 處的負(fù)峰被選作指標(biāo)，用于監(jiān) 測生物仿制藥和創(chuàng)新藥物 mAb 中色氨 酸殘基微環(huán)境的改變。 使用 Cary 60 收集二階導(dǎo)數(shù)吸收光譜 后，在化學(xué)變性劑 GdnHCl 存在的條 件下，通過比較每種藥物對變性作用 的敏感程度來比較利妥昔單抗生物仿 制藥和創(chuàng)新藥物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。圖 2 顯示了 0 和 5 M GdnHCl 時創(chuàng)新藥物和 生物仿制藥的二階導(dǎo)數(shù)吸收光譜。當(dāng) mAb 樣品溶于 GdnHCl 時，檢測光譜顯 示，291 nm 附近的負(fù)吸收峰發(fā)生了位 移（如圖 2 中箭頭所示）。這表明 mAb 中色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了改變。

通過增加 GdnHCl 的濃度對創(chuàng)新藥物和 生物仿制藥的變性作用進(jìn)行了比較。 圖 3 顯示了溶解 mAb 的 GdnHCl 濃度 增加時發(fā)生的波長位移。創(chuàng)新藥物和 生物仿制藥在相近的 GdnHCl 濃度下 都發(fā)生了變性，這表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中 色氨酸殘基的微環(huán)境是相似的。采用 Cary 60 紫外-可見分光光度計得到的 這一結(jié)果證實了早期采用反相高效液相色譜法 (RP-HPLC)、尺寸排阻色譜法 (SEC) 和肽譜分析得到的研究結(jié)果， 即采用安捷倫 HPLC 解決方案時這對 mAb 的初級和高級結(jié)構(gòu)均相似7 。 通過采用導(dǎo)數(shù)光譜法生成 a/b 來分析 蛋白質(zhì)序列中酪氨酸殘基的微環(huán)境， 這樣比較蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也是可行的8,9， 其中，a 代表酪氨酸產(chǎn)生的負(fù)峰吸光 度的最大值 (~λ288) 和最小值 (~λ283) 之 間的距離，b 代表色氨酸吸收產(chǎn)生的 第二大值 (~λ294) 和最小值 (~λ291) 之間 的距離（圖 4 插圖）。圖 4 顯示了在 GdnHCl 濃度增加的條件下，a/b 隨蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變而改變。低濃度時， a/b 約為 1.05，這與蛋白質(zhì)球狀結(jié)構(gòu) 一致9 。高濃度時，a/b 增加，這表明 暴露的酪氨酸殘基越來越多。創(chuàng)新藥 物和生物仿制藥具有相似的光譜輪 廓，這表明兩種 mAb 中酪氨酸的微環(huán) 境相似。

紫外-可見分光光度法能夠獲得精密、 詳細(xì)和準(zhǔn)確的信息，凸顯了這項技術(shù) 的潛力。另外，作為一種可以減輕其 他重要分析儀器工作負(fù)荷的替代分析 技術(shù)，紫外-可見分光光度計這種經(jīng)濟(jì) 實惠、簡單易用的儀器在實驗室中的 應(yīng)用潛力不可低估。 結(jié)論 • 對于創(chuàng)新藥物和生物仿制藥 mAb 對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的比較，Agilent Cary 60 紫外-可見分光光度計提 供了必要的分辨率和準(zhǔn)確度 • 所研究的 mAb 創(chuàng)新藥物和生物 仿制藥對化學(xué)變性劑 (GdnHCl) 表現(xiàn)出相似的伸展類型。這一 結(jié)果表明，這對 mAb 的蛋白質(zhì) 總體結(jié)構(gòu)相似 • 這項研究還表明，二階導(dǎo)數(shù)吸 收光譜可用于比較創(chuàng)新藥物和 生物仿制藥 mAb 的結(jié)構(gòu)研究