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摘要：由亞磷酰胺化學(xué)法合成的寡核苷酸通常使用離子對(duì)反相液相色譜 (IP-RPLC) 和陰離 子交換色譜進(jìn)行分析和純化。在 IP-RPLC 分析中，陰離子交換純化餾分的高含鹽量 會(huì)削弱寡核苷酸參與離子配對(duì)的能力。這就需要在 IP-RPLC 分析之前對(duì)樣品進(jìn)行脫 鹽，這一步驟通常使用離心過(guò)濾器手動(dòng)完成。 本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)展示了高鹽濃度溶液中寡核苷酸的直接二維液相色譜分析：在第一維 ( 1 D) 中進(jìn)行在線脫鹽，隨后在第二維 (2 D) 中進(jìn)行 IP-RPLC 分析。在該設(shè)置中，二維 液相色譜的使用提高了工作流程速度，同時(shí)避免了手動(dòng)的樣品前處理過(guò)程。

前言：在分子生物學(xué)和分子診斷中，聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng) (PCR)、基因沉默以及相關(guān)技術(shù)1 都 需要標(biāo)準(zhǔn)的和經(jīng)修飾的合成寡核苷酸。此 外，合成寡核苷酸在作為治療劑治療各種 疾?。ɡ绨┌Y和病毒性疾?。┓矫娴闹?要性日益突顯2 。寡核苷酸類藥物包括反 義寡核苷酸、小干擾 RNA (siRNA) 和適 配體。反義寡核苷酸和 siRNA 均通過(guò)阻 止 mRNA 翻譯從而阻止蛋白質(zhì)合成。適 配體通過(guò)形成適配體-蛋白質(zhì)復(fù)合物，從 而抑制蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能3 。 寡核苷酸通常通過(guò)亞磷酰胺化學(xué)法合成2,4。 可獲得的純度通常大于 70%，合成后存 在的常見(jiàn)雜質(zhì)包括缺失或增加序列的寡核 苷酸連同未*去保護(hù)的產(chǎn)物、缺失嘌呤 堿基的寡核苷酸以及其他降解產(chǎn)物2 。通 常使用離子對(duì)反相液相色譜 (IP-RPLC) 和 陰離子交換色譜對(duì)合成的去保護(hù)寡核苷酸 進(jìn)行分析分離與純化2,4。陰離子交換純化餾分通常含有高濃度的 鹽，如氯化鈉 (NaCl) 或溴化鈉 (NaBr)。 當(dāng)使用 IP-RPLC 對(duì)這些餾分進(jìn)行分析時(shí)， 高濃度的鹽會(huì)削弱寡核苷酸參與離子配對(duì) 的能力，從而導(dǎo)致保留時(shí)間變化、峰分裂 以及峰流穿5 。為了對(duì)陰離子交換純化餾 分進(jìn)行成功的 IP-RPLC 分析，需要在分 析前對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽5 ，而這一過(guò)程通常 手動(dòng)完成。 本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)展示了高鹽濃度溶液中寡核苷 酸的直接二維液相色譜分析，這一鹽濃度 與寡核苷酸合成后陰離子交換純化餾分中 的鹽濃度相當(dāng)。二維液相色譜分析的第一 維用于在線脫鹽，隨后在第二維中進(jìn)行 IP-RPLC 分析。在該設(shè)置中，二維液相色 譜的使用可以節(jié)省時(shí)間并避免手動(dòng)的樣品 前處理步驟。省去手動(dòng)樣品前處理步驟可 以提高重現(xiàn)性，且可以避免樣品前處理過(guò) 程中的樣品損失。

實(shí)驗(yàn)部分 設(shè)備 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜系統(tǒng) 包括以下模塊： • 兩臺(tái) Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配備冷卻裝置（選件 #100） • 兩臺(tái) Agilent 1290 Infinity II 高容量柱 溫箱 (G7116B) • 兩臺(tái) Agilent 1290 Infinity II 二極管陣 列檢測(cè)器 (G7117B)，配備 10 mm 最 大光強(qiáng)卡套式流通池 (G4212-60008) • Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動(dòng) (G1170A)，帶二維液相色譜閥、 主動(dòng)溶劑調(diào)制 (G4243A) • 兩個(gè) Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動(dòng) (G1170A)，配備帶 40 µL 定量環(huán)的 多中心切割閥 (G4242-64000) 軟件 Agilent OpenLab CDS ChemStation 版， 版本 C.01.08 [210] 以及二維液相色譜軟 件，版本 A.01.04 SR1。 色譜柱 • Agilent PLRP-S 100 ?, 2.1 × 50 mm, 3 µm（部件號(hào) PL1912-1300） • Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色譜 柱，2.1 × 50 mm, 2.7 µm（部件號(hào) 659750-702）

化學(xué)品 所有試劑純度均為液相色譜級(jí)。甲醇購(gòu) 自 Merck (Darmstadt, Germany)。新制超 純水來(lái)自配置 0.22 µm 膜式終端過(guò)濾器 (Millipak) 的 Milli-Q 超純實(shí)驗(yàn)室水純化系統(tǒng) (Millipore, Merck (Darmstadt, Germany))。 乙酸銨和六氟異丙醇 (HFIP) 購(gòu)自 Merck (Darmstadt, Germany)。三乙胺 (TEA) 和 氨水分別購(gòu)自 Fluka (Steinheim, Germany) 和 VWR (Darmstadt, Germany)。 樣品與樣品前處理 將寡核苷酸分離度標(biāo)準(zhǔn)品、RNA 和 DNA 樣品溶于水。得到的儲(chǔ)備液用水或 2 mol/L NaCl 溶液按 1:1 進(jìn)一步稀釋，使水或 1 mol/L NaCl 溶液中具有相同濃度的寡核 苷酸。1 mol/L NaCl 的寡核苷酸溶液用 于模擬具有高鹽濃度的陰離子交換純化 餾分。 使用 Microcon YM-3 離心過(guò)濾器以及 3 kDa NMWCO (Millipore, Merck (Darmstadt, Germany)）按以下步驟對(duì) 1 mol/L NaCl 的寡核苷酸溶液進(jìn)行手動(dòng) 脫鹽： • 將 1 mol/L NaCl 的寡核苷酸溶液 (200 µL) 轉(zhuǎn)移到樣品儲(chǔ)液槽，14000 g 離心 30 分鐘，以濃縮寡核苷酸并洗 脫鹽分 • 將 200 µL 水轉(zhuǎn)移到樣品儲(chǔ)液槽， 14000 g 離心 30 分鐘以進(jìn)行清洗• 將樣品儲(chǔ)液槽顛倒放入一個(gè)干凈的樣 品瓶，1000 g 離心 3 分鐘，以使?jié)?縮物轉(zhuǎn)移到樣品瓶中 • 用水將濃縮物復(fù)溶，最終體積約為 200 µL

寡核苷酸分離度標(biāo)準(zhǔn)品（部件號(hào) 5190-9028）： 14 mer：rCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU 17 mer：rUrCrArCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU 20 mer：rUrCrArUrCrArCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU 21 mer：rGrUrCrArUrCrArCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU RNA 樣品（RNA/2’-OMethyl 混合；安捷倫 NSAD 合成）： 5’-GuGcCaAcCuGaUgCaGcU-3’，大寫(xiě)字母：RNA，小寫(xiě)字母：OMethyl DNA 樣品（*硫醇化；安捷倫 NSAD 合成）： 5’-ugcaCCCTGGATACCauuu-3’，大寫(xiě)字母：DNA，小寫(xiě)字母：OMethyl

結(jié)果與討論 圖 1 展示了水（圖 1A）和 1 mol/L NaCl 溶液（圖 1B）中寡核苷酸分離度標(biāo)準(zhǔn)品 的一維 IP-RPLC 分析。圖 1B 清楚地顯示 注入的寡核苷酸溶液中的高濃度鹽會(huì)削弱 其參與離子配對(duì)的能力，從而導(dǎo)致峰分裂 以及峰流穿（可看見(jiàn)較大的進(jìn)樣峰）。 從圖 2 經(jīng)脫鹽的寡核苷酸溶液的 IP-RPLC 分析可以看出，用離心過(guò)濾器對(duì) 1 mol/L NaCl 的寡核苷酸分離度標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行 手動(dòng)脫鹽后可避免峰分裂以及峰流穿。然 而，使用離心過(guò)濾器進(jìn)行手動(dòng)脫鹽是一個(gè) 費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過(guò)程，通常耗費(fèi)約 75 分鐘。 此外，手動(dòng)脫鹽后單個(gè)寡核苷酸的強(qiáng)度比 發(fā)生了變化，這很可能是由較小的寡核苷 酸部分損失所致。 使用配備主動(dòng)溶劑調(diào)制的 1290 Infinity II 二維液相色譜系統(tǒng)的中心切割二維液相色 譜可實(shí)現(xiàn)高鹽濃度溶液中寡核苷酸的直接 分析。二維液相色譜分析的第一維用于 在線脫鹽，隨后在第二維中進(jìn)行 IP-RPLC 分析。