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摘要：多個(gè)國(guó)家規(guī)定了食品中真菌毒素的含量限值。然而，某些食品中含有復(fù)雜的蛋白質(zhì) 和脂質(zhì)，為準(zhǔn)確定量分析這些基質(zhì)中的低濃度真菌毒素帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。本應(yīng)用 簡(jiǎn)報(bào)介紹了采用快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效、耐用和安全 (QuEChERS) 的工作流程和 Agilent Captiva EMR-Lipid 過(guò)濾柱凈化測(cè)定固態(tài)和液態(tài)嬰兒配方奶中的 13 種真菌毒 素。由于 Captiva EMR-Lipid 吸附劑的高選擇性，所有真菌毒素均獲得了出色的回收 率 (70.4%–106.8%) 和精密度 (RSD < 18%)。這一簡(jiǎn)單而穩(wěn)定的方法僅需極少設(shè)備和 專(zhuān)業(yè)技術(shù)，因此可輕松應(yīng)用于食品實(shí)驗(yàn)室。

前言：真菌毒素是谷物、玉米和堅(jiān)果等多種農(nóng)作物上真菌物種的次級(jí) 代謝物。當(dāng)奶牛食用了受污染的飼料后，真菌毒素及其代謝 物會(huì)分泌到牛奶中1 。黃曲霉毒素 M1 是牛奶中最常見(jiàn)的真菌 毒素，許多國(guó)家/地區(qū)都對(duì)其進(jìn)行了監(jiān)測(cè)和監(jiān)管，包括美國(guó)和 歐洲國(guó)家2,3。盡管還沒(méi)有針對(duì)牛奶中其他真菌毒素的法規(guī)，但 對(duì)其他真菌毒素（如伏馬菌素和赭曲霉毒素）的監(jiān)測(cè)也日漸 增多。 由于法規(guī)限值非常低，尤其是在嬰兒配方奶中，因此，為去除 基質(zhì)干擾以增強(qiáng)低濃度分析物的信號(hào)，樣品前處理不可少。 免疫分析或 LC/MS 方法，結(jié)合樣品前處理技術(shù)（如免疫親 和、固相萃取 (SPE) 或穩(wěn)定同位素稀釋4 ）可用于分析真菌毒 素。但是，復(fù)雜的多脂樣品由于基質(zhì)組分（如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)） 濃度較高，其分析尤為棘手。免疫親和柱價(jià)格昂貴，且只能用 于特定的分析物、化合物類(lèi)別或樣品類(lèi)型。其他凈化產(chǎn)品可能 缺乏對(duì)目標(biāo)分析物的選擇性，無(wú)法有效去除脂質(zhì)，從而導(dǎo)致分 析重現(xiàn)性差、基質(zhì)效應(yīng)明顯，并使基質(zhì)在儀器中聚集。 Agilent Captiva EMR-Lipid 是一款脂質(zhì)去除產(chǎn)品，結(jié)合了體積 排阻與疏水相互作用兩種凈化機(jī)制，能夠選擇性地捕獲脂類(lèi) 烴鏈，同時(shí)不損失目標(biāo)分析物。Captiva EMR-Lipid 凈化管現(xiàn) 有 3 mL 和 6 mL 兩種體積，可提供一種簡(jiǎn)單的流通式凈化， 能夠從多脂樣品萃取物中選擇性地去除脂質(zhì)，適用于多類(lèi)別、 多殘留分析。使用 QuEChERS 萃取從液態(tài)嬰兒配方奶和嬰兒 配方奶粉中萃取 13 種真菌毒素。QuEChERS 方法因其能夠高 效萃取多個(gè)類(lèi)別的分析物而著稱(chēng)，但該方法同時(shí)也會(huì)萃取出大 量基質(zhì)。Captiva EMR-Lipid 過(guò)濾柱具有高脂質(zhì)去除率，有助 于分析人員準(zhǔn)確定量目標(biāo)真菌毒素。此外，通過(guò)分析嬰兒配方 奶樣品中三種加標(biāo)濃度下的黃曲霉毒素（AF-B1、B2、G1、 G2 和 M1）、赭曲霉毒素（OTA 和 OTB）、伏馬菌素（FB1、 FB2 和 FB3）、玉米赤霉烯酮 (ZON)、霉酚酸 (MPA) 和雜色曲 霉素 (STC) 對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)于這類(lèi)復(fù)雜脂肪基質(zhì)中痕 量真菌毒素的分析，該方法表現(xiàn)出了優(yōu)異的回收率、精密度和 靈敏度。

實(shí)驗(yàn)部分 樣品前處理 • Captiva EMR-Lipid 3 mL 凈化管（部件號(hào) 5190-1003） • Captiva EMR-Lipid 6 mL 凈化管（部件號(hào) 5190-1004） • QuEChERS Original 萃取鹽（部件號(hào) 5982-5555） • VacElut SPS 24 位真空萃取裝置（部件號(hào) 12234022）

化學(xué)品與試劑 從當(dāng)?shù)仉s貨店購(gòu)買(mǎi)食品樣品用于方法定量和基質(zhì)去除研究。標(biāo) 準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)以預(yù)混合溶液的形式購(gòu)自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 或 Romer Labs (Getzersdorf, Austria)。LC 溶劑購(gòu)自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。 驗(yàn)證研究 通過(guò)分批分析驗(yàn)證嬰兒配方奶中的真菌毒素，包括兩個(gè)雙空白 樣品、兩個(gè)空白樣品、六個(gè)校準(zhǔn)品和三種 QC 濃度。QC 樣品 的預(yù)加標(biāo)濃度如表 1 所示，每個(gè)樣品重復(fù)六次 (n = 6)，并在 兩組校準(zhǔn)曲線之間進(jìn)樣。使用六種濃度的校準(zhǔn)品繪制校準(zhǔn)曲 線，如下所示： • 對(duì)于 AF-B1、AF-B2、AF-G1、AF-G2、MPA、OTA、STC 和 ZON，采用 0.25、1、5、10、20、40 ng/mL • 對(duì)于 AF-M1 和 OTB，采用 0.125、0.5、2.5、5、10、 20 ng/mL • 對(duì)于 FB1、FB2 和 FB3，采用 1.25、5、25、50、100、 200 ng/mL 同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo) 13C17-AF-B1 的加標(biāo)濃度為 5 ng/mL。

樣品前處理的詳細(xì)步驟 對(duì)于嬰兒配方奶粉 (5 g)，向校準(zhǔn)品和 QC 樣品中預(yù)加標(biāo)適當(dāng) 濃度的目標(biāo)分析物，萃取之前，使其*浸入至少 1 小時(shí)。 接下來(lái)加入 10 mL 水，使其浸入樣品中。對(duì)于液態(tài)嬰兒配方 奶，使用 10 g 樣品進(jìn)行萃取，并相應(yīng)地對(duì)校準(zhǔn)品和 QC 樣品 預(yù)加標(biāo)，無(wú)需再加水。對(duì)于嬰兒配方奶粉和液態(tài)嬰兒配方奶， 加入 10 mL 乙腈（含 2% 甲酸）和 QuEChERS 萃取鹽（4 g MgSO4，1.5 g NaCl），在 Geno/Grinder 上垂直振蕩 10 分鐘以 萃取樣品。然后在 5000 rpm 下離心 5 分鐘。移取上層乙腈相 (8 mL) 至潔凈的 15 mL 試管中，加入 2 mL 水進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄋ?的體積百分比為 20%）并渦旋混合。將萃取物 (2.5 mL) 上樣 到 3 mL Captiva EMR-Lipid 凈化管，使其在重力作用下流過(guò)凈 化管。待萃取物*從 Captiva EMR-Lipid 凈化管中洗脫之后 （約 10 分鐘），施加真空，將真空度從 1 增加到 10 英寸汞柱 以排空凈化管。對(duì)于預(yù)加標(biāo)樣品，將 0.500 mL 洗脫液轉(zhuǎn)移到 自動(dòng)進(jìn)樣器管中，加入 0.300 mL 含 0.1% 甲酸的 5 mmol/L 甲 酸銨。將 0.500 mL 空白洗脫液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣器管中，加入 0.270 mL 含 0.1% 甲酸的 5 mmol/L 甲酸銨和 0.030 mL 適當(dāng) 的工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，來(lái)配制基質(zhì)匹配的校準(zhǔn)物。

結(jié)果與討論 線性 使用 Agilent MassHunter 定量分析軟件處理數(shù)據(jù)。使用線性回 歸擬合和 1/x2 加權(quán)得到 13 種真菌毒素的校準(zhǔn)曲線，其 R2 值均 在 0.992–0.998 之間。所有校準(zhǔn)品的準(zhǔn)確度都在預(yù)期值 ±10% 以內(nèi)。 準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果 本研究獲得了出色的結(jié)果，結(jié)果匯總?cè)绫?2 所示。所有 QC 樣 品的回收率都在 70%–120% 范圍內(nèi)，所有濃度下的 %RSD 均 小于 20，其中大多數(shù)分析物的 %RSD 小于 10。由于乙腈對(duì)伏 馬菌素的萃取能力較差，伏馬菌素成為了本研究中一類(lèi)具 有挑戰(zhàn)性的真菌毒素。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，加入 2% 甲酸可大幅提 高該類(lèi)分析物的溶解度，且不會(huì)對(duì)其他類(lèi)別的分析物產(chǎn)生不利 影響。 EMR-Lipid 機(jī)制 EMR-Lipid 的選擇性得益于體積排阻和疏水相互作用兩種機(jī)制 的結(jié)合。脂類(lèi)具有線性、無(wú)支鏈的烴鏈，其分子足夠小，可以 進(jìn)入 EMR-Lipid 吸附劑中。一旦進(jìn)入吸附劑中，脂類(lèi)就會(huì)因疏 水相互作用而被牢牢捕獲。大多數(shù)分析物都不含線性、無(wú)支鏈 的烴鏈結(jié)構(gòu)，因此不會(huì)進(jìn)入吸附劑中，而是留在溶液中以待分 析。較短的烴鏈（少于六個(gè)碳原子）與 EMR-Lipid 的結(jié)合不夠 強(qiáng)，因此無(wú)法像烴鏈較長(zhǎng)的脂類(lèi)那樣得到有效去除。EMR-Lipid *的凈化機(jī)制以基質(zhì)干擾物而不是各種類(lèi)別的分析物為捕集 目標(biāo)，非常適用于多類(lèi)別、多殘留分析。

競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品比較 ― 回收率和精密度 對(duì) Captiva EMR-Lipid（6 mL 小柱）和市售直通式凈化產(chǎn)品 （競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)品 A，6 mL，500 mg）的回收率和精密度進(jìn)行評(píng)估。 在此次評(píng)估過(guò)程中，直接對(duì)嬰兒配方奶萃取物進(jìn)行加標(biāo)，以排 除萃取過(guò)程對(duì)回收率和精密度的影響。表 3 中匯總的評(píng)估結(jié)果 表明，使用 Captiva EMR-Lipid 的回收率更高，尤其是對(duì)于玉 米赤霉烯酮、赭曲霉毒素 A 和雜色曲霉素。Captiva EMR-Lipid *的吸附劑化學(xué)機(jī)制能夠選擇性地捕獲脂質(zhì)，而目前的市售 產(chǎn)品往往會(huì)將不需要的分析物保留下來(lái)（尤其是具有較強(qiáng)疏水 性的分析物）。 使用氣質(zhì)聯(lián)用儀GC/MS監(jiān)測(cè)基質(zhì)去除率 盡管已經(jīng)使用 LC/MS 完成了驗(yàn)證，但通過(guò)比較樣品凈化產(chǎn)物 的 GC/MS 全掃描結(jié)果仍可獲取有關(guān)基質(zhì)和脂質(zhì)去除情況的重 要信息。圖 1 所示為嬰兒配方奶在 Captiva EMR-Lipid 凈化前 后的 GC/MS 全掃描色譜圖。黑線為未凈化樣品的色譜圖，表 明存在脂質(zhì)及其他基質(zhì)共萃取物。Captiva EMR-Lipid 凈化后 的液態(tài)嬰兒配方奶（紫線）的去除率為 90%（根據(jù)公式 1 計(jì) 算得到）。晚洗脫基質(zhì)被*去除，早洗脫基質(zhì)顯著減少但未 *去除。

結(jié)論 本研究證明 Captiva EMR-Lipid 是一種簡(jiǎn)便有效的凈化方法， 適用于多種真菌毒素的分析。嬰兒配方奶的驗(yàn)證結(jié)果表明方法 具有優(yōu)異的回收率（70.4%–106.8%）和精密度 (RSD < 18%)， 且靈敏度可達(dá) 1.0 ng/g。GC/MS 全掃描結(jié)果表明該方法可實(shí) 現(xiàn)高效凈化。產(chǎn)品比較結(jié)果表明，使用 Captiva EMR-Lipid 的 真菌毒素回收率遠(yuǎn)優(yōu)于其他市售凈化產(chǎn)品。該方法在多種應(yīng)用 中都具有較高的基質(zhì)脂質(zhì)去除率以及分析物回收率，但其中一 些應(yīng)用不在本研究的范圍之內(nèi)5,6。Captiva EMR-Lipid 代表了用 于多類(lèi)別、多殘留分析的新一代選擇性脂質(zhì)凈化產(chǎn)品，對(duì)于需 要簡(jiǎn)化樣品前處理并改善方法性能的實(shí)驗(yàn)室而言，該產(chǎn)品是理 想之選。