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Agilent 8890氣相色譜儀的脂肪酸甲酯分析
閱讀：2590 發(fā)布時間：2021-10-8摘要 ：本應(yīng)用簡報采用方法使用長極性色譜柱在 Agilent 8890 氣相色譜儀上進(jìn)行 FAME 分析。氣相色譜方法經(jīng)過優(yōu)化用于在 80 分鐘 內(nèi)分離 37 種代表性 FAME 和 21 種代表性反式 FAME。評估了系統(tǒng)保留時間 (RT)、 峰面積重現(xiàn)性和線性，并分析了由實際油樣制得的 FAME 混合物。
前言：脂肪主要為脂肪酸和甘油的三酯，通常稱 為甘油三酯。出于對營養(yǎng)標(biāo)簽的考慮，脂 肪被定義為食品中脂肪酸的總和，不論其 來源，均表示為甘油三酯當(dāng)量。脂肪酸包 括不同類型，根據(jù)其不飽和度可分為：飽 和、單不飽和及多不飽和。反式脂肪酸是 不飽和脂肪酸，其含有至少一個非共軛和 反式雙鍵。 食品中的脂肪含量一直以來都是被廣泛討 論和審查的營養(yǎng)元素。出于健康、營養(yǎng)、 減肥等目的，許多消費者十分關(guān)注食品中 的脂肪含量。 目前已開發(fā)了多種方法用于分析食品中 的脂肪，例如 GB 5009.168-20161 和 GB 5009.257-20162 。以上兩種方法描述了從 不同食物基質(zhì)中提取脂肪，將脂肪酸進(jìn)行 酯交換生成脂肪酸甲酯 (FAME) 的方法， 以及推薦用于分離和數(shù)據(jù)分析的氣相色譜 方法。方法 168 主要集中于 37 種代表性 脂肪酸的分析，而方法 257 則側(cè)重于反 式脂肪酸的分析。
材料：設(shè)備 • Agilent 8890 氣相色譜儀，配備分流/ 不分流進(jìn)樣口和 FID 檢測器 • Agilent 7693A 自動液體進(jìn)樣器 (ALS) （部件號 G4567A） 化學(xué)品 • 37 組分 FAME 混標(biāo) (CDAA-252795- MIX-1 mL) 購自上海安譜實驗科技 股份有限公司，含有濃度范圍在 200–400 ng/µL 的 C4–C24 FAME
• 13 組分反式 FAME 混標(biāo)（CDAA2527，15–100 mg）和 8 組分順式/ 反式十八碳三烯酸甲酯 (CDABCRM47792) 購自上海安譜實驗科技 股份有限公司，兩種混標(biāo)中每種組分 的重量百分比范圍為 3%–30% 樣品 大豆油、花生油和芝麻油樣品由上海市質(zhì) 量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院根據(jù) GB 5009.168- 2016 提供并進(jìn)行前處理。
結(jié)果與討論 使用 GB 5009.168-2016 中推薦的柱溫箱 升溫程序。使用恒壓模式，柱頭壓經(jīng)優(yōu)化 采用 40 psi 以獲得滿意的分離，其中關(guān) 鍵物質(zhì)對 (C20:0/C20:3n6) 的最小分離度 為 1.3，超過了該方法規(guī)定的 1.25 的分離 度要求。
將 37 種 FAME 的混標(biāo)稀釋至每種組分為 50–100 ng/µL，用于測試系統(tǒng)重現(xiàn)性。該 標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù) GB 方法選擇，并且它經(jīng)過專 門配制可用于模擬許多食品樣品的脂肪酸 組成。柱溫箱升溫程序較長，如圖所示， 37 種 FAME 在 81 分鐘內(nèi)分離（圖 1）。 所有組分都得到了良好的分離。六次進(jìn) 樣的疊加色譜圖顯示了出色的峰面積和 RT 重現(xiàn)性（圖 1）。表 2 列出了每個峰的 RT、峰面積和精密度。峰面積重現(xiàn)性在
1.1%–3.4% 范圍內(nèi)（圖 2），其中一個組 分的峰面積 RSD% 達(dá)到了 4.0%。由于樣 品溶劑為己烷，且每次進(jìn)樣的運(yùn)行時間超 過 80 分鐘，因此在分離期間樣品（尤其 是溶劑）的蒸發(fā)導(dǎo)致樣品濃度略有變化。 每種組分上樣到色譜柱上的樣品量在 0.5–1 ng 范圍內(nèi)。樣品量少以及溶劑的 蒸發(fā)導(dǎo)致峰面積 RSD% 略高過 2%，但仍 然符合定量分析要求。
保留時間重現(xiàn)性在 0.01%–0.03% 范圍內(nèi) （圖 3）。盡管長時間運(yùn)行很難使系統(tǒng)實現(xiàn) 出色的重現(xiàn)性，但 8890A 氣相色譜儀可 以精準(zhǔn)、穩(wěn)定地控制柱溫箱溫度、進(jìn)樣口 壓力和檢測器流速，有助于生成高度可 重現(xiàn)的色譜圖，并確保得到可靠的鑒定 結(jié)果。
通過計算五個濃度水平下 C18:1c FAME 和 C18:2c FAME 的響應(yīng)因子 (RF) 的相對 標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD%) 來評估系統(tǒng)線性。表 3 中兩種探針化合物的 RF RSD% 低至 4%， 在峰響應(yīng)方面表現(xiàn)出優(yōu)異的線性。一些 實驗室使用 ESTD 方法進(jìn)行定量分析，即 使使用單點 ESTD 方法，較寬濃度范圍內(nèi) 出色的檢測器線性也可確保準(zhǔn)確的定量 分析。 圖 4 展示了 13 組分反式 FAME 和 8 組分 十八碳三烯酸甲酯異構(gòu)體的混合物的分 離。根據(jù) GB 5009.257-2016 得到結(jié)果。 所使用的柱溫箱升溫程序與 37 種 FAME 混標(biāo)的分析相同。C18:3 反式 FAME 異構(gòu) 體的 8 種異構(gòu)體特別難以分離，特別是 考慮到與 C18:3 FAME 共存的其他 FAME 必須在同一次運(yùn)行中分離。然而，在十八 碳三烯酸甲酯洗脫部分的放大視圖中，八 種異構(gòu)體在 100 m HP-88 色譜柱上產(chǎn)生 了八個峰（圖 5）。雖然分離度遠(yuǎn)不及基 線分離，但與 GB 5009.257-2016 中參比 色譜圖的對比表明，所實現(xiàn)的分離在可接 受范圍內(nèi)。此外，順式-9,12,15-十八碳三 烯酸甲酯能與其他七種反式異構(gòu)體很好地 分離。鑒于營養(yǎng)標(biāo)簽行業(yè)中對反式脂肪酸 的標(biāo)示，這是一個十分重要的實際考慮 因素。
根據(jù) GB 5009.168-2016，在 8890 氣 相色譜平臺上對實際油樣品（包括大豆 油、花生油和芝麻油）進(jìn)行提取、衍生 化和分析。圖 6A、6B 和 6C 所示為生成 的色譜圖。C16:0、C18:0、C18:1n9c、 C18:2n6c、C18:3n3 和 C20:1 是三種油 樣品中鑒定出的主要脂肪酸（圖 6A、6B 和 6C 中的紅色字體標(biāo)簽是方法校準(zhǔn)表 中列出，但未在實際樣品中鑒定出的化 合物）。 有一種 FAME 分析解決方案可在較短的 聚氰丙基硅氧烷色譜柱上在 10 分鐘內(nèi)快 速分離 37 種代表性 FAME，從而實現(xiàn)快 速分析3 。然而，快速分析對順式和反式 FAME 的分離存在某些限制。因此開發(fā)了 使用長極性色譜柱的 60–80 分鐘的 FAME 分析方法，以處理需要分離復(fù)雜順式/ 反式脂肪酸或其他具有分離難度的異構(gòu)體 的樣品。在某些應(yīng)用中，例如特級初榨橄 欖油的質(zhì)量測試，順式/反式 FAME 的有 效分離比分析時間更為重要。
結(jié)論 使用 8890A 氣相色譜儀和 HP-88 色譜 柱分析 37 種代表性 FAME 和 21 種反式 FAME，結(jié)果證明兩種類型的樣品均得到 了很好的分離。關(guān)鍵化合物對的分離度滿 足甚至超出了 GB 5009.168-2016 和 GB 5009.257-2016 方法的要求。出色的保留 時間和峰面積重現(xiàn)性以及 FID 的寬線性檢 測范圍證明 8890A 氣相色譜儀是可靠地 分析 FAME 的理想平臺。