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摘要：本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了一種利用 Agilent 6470B 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)檢測(cè)食品基質(zhì)中 244 種農(nóng)藥殘留的 LC/MS/MS 篩查方法。有機(jī)橙子和紅茶由于所含成分復(fù)雜，因此 被選擇用于評(píng)估該方法檢測(cè)食品基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的性能。在橙子基質(zhì)中，除一種目 標(biāo)農(nóng)藥外，其余所有目標(biāo)農(nóng)藥均可在小于或等于歐盟委員會(huì)規(guī)定的默認(rèn)最大殘留限 量 (MRL) 10 µg/kg 的水平被檢出[1]。在濃紅茶基質(zhì)中，239 種農(nóng)藥可在小于或等于 10 µg/kg 的濃度被檢出。研究人員還研究了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)分析物響應(yīng)的影響，結(jié)果表 明，橙子基質(zhì)和紅茶基質(zhì)中分別有 50% 和 40% 的農(nóng)藥可在 SANTE 指導(dǎo)原則要求的 范圍內(nèi) (80%–120%) 得到回收[2]。這些結(jié)果證明，6470B 三重四極桿 LC/MS 可滿足 高靈敏度要求，能夠?qū)κ称坊|(zhì)中的農(nóng)藥進(jìn)行準(zhǔn)確、精密地定量分析。

前言：農(nóng)藥對(duì)于保護(hù)農(nóng)作物起著*的作 用，在大多數(shù)農(nóng)產(chǎn)品的生長(zhǎng)環(huán)境中，為實(shí) 現(xiàn)高產(chǎn)量，往往需要使用農(nóng)藥。因此，我 們十分關(guān)心所購(gòu)買的農(nóng)產(chǎn)品中是否存在農(nóng) 藥及其含量。在如今各類有機(jī)產(chǎn)品和無(wú)機(jī) 產(chǎn)品琳瑯滿目的市場(chǎng)上，這一點(diǎn)尤其值得 關(guān)注，因?yàn)槭称氛鎮(zhèn)位蚴称肺廴緯?huì)影響有 機(jī)食品的質(zhì)量。監(jiān)管機(jī)構(gòu)（例如，美國(guó)環(huán) 保局 (US-EPA)[1,3] 和歐盟委員會(huì)[4]）制定 了相應(yīng)的法規(guī)來(lái)限制農(nóng)藥的使用以及允許 量，從而保證消費(fèi)者購(gòu)買到安全的食品。 最大殘留* (MRL) 是指正確使用農(nóng)藥 時(shí)（良好的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式），食品或飼 料內(nèi)部或表面所含法律容許農(nóng)藥殘留的高水平。在食品中，典型的 MRL 約為 µg/kg 級(jí)（十億分之一 (ppb)），因此需要 使用非常靈敏的儀器來(lái)檢測(cè)化合物。對(duì)于 紅茶等含有多種內(nèi)源性組分的食品尤其如 此，因?yàn)檫@些內(nèi)源性組分會(huì)造成嚴(yán)重基質(zhì) 效應(yīng)。 本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了一種 LC/MS/MS 篩查 方法，該方法可對(duì)復(fù)雜多樣的食品基質(zhì) 中所含的 244 種農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)和定量。 將安捷倫農(nóng)藥全套測(cè)試混標(biāo)分別加入有 機(jī)紅茶提取物和全橙提取物中。提取物 按照下文所述的 Agilent QuEChERS 萃 取和 EN 分散 SPE 方案制備。將 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜與 6470B 三重四極桿 LC/MS 聯(lián)用，以動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (dMRM) 方法分析樣品。6470B 三重四極 桿 LC/MS 進(jìn)行了多方面的硬件改進(jìn)，例 如采用 VacShield 技術(shù)，離子源無(wú)需放空 即可維護(hù)，有利于延長(zhǎng)儀器正常運(yùn)行時(shí) 間；采用更快速的電子器件，具有改善的 穩(wěn)定時(shí)間參數(shù)，能夠在極低的駐留時(shí)間下 保證色譜峰重現(xiàn)性。

實(shí)驗(yàn)部分：試劑與標(biāo)準(zhǔn)品 本研究使用了安捷倫農(nóng)藥全套測(cè)試混 標(biāo)（部件號(hào) 5190-0551）。將農(nóng)藥全套測(cè) 試混標(biāo)的八種子混合物進(jìn)行混合，然后 用乙腈 (ACN) 稀釋得到最終農(nóng)藥工作溶 液，該溶液濃度為 10 µg/g。將該溶液 加入 QuEChERS 提取物中用于制備校準(zhǔn) 樣品。為確定樣品基質(zhì)中的方法檢測(cè)限 (MDL) 和定量下限 (LLOQ)，使用紅茶和 有機(jī)橙樣品提取物分別制備了 7 個(gè)濃度在 0.5–100 ppb 之間的校準(zhǔn)樣品。 所有試劑和溶劑均為 HPLC 或 LC/MS 級(jí)。 乙腈和甲醇購(gòu)自 Honeywell (Morristown, NJ, USA)。超純水產(chǎn)自配備 LC-Pak Polisher 和 0.22 µm 膜式終端過(guò)濾器濾芯的 Milli-Q Integral 系統(tǒng) (EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。甲酸和甲酸銨購(gòu)自 Fluka（SigmaAldrich 公司，St. Louis, MO, USA）。

樣品前處理 有機(jī)散葉紅茶和有機(jī)橙購(gòu)自當(dāng)?shù)仉s貨店。 用 8 mL 水將 2 g 茶葉樣品潤(rùn)濕，并使樣 品在室溫下溫育 2 小時(shí)。利用陶瓷均質(zhì)子 （部件號(hào) 5982-9312）制出充分混合的均 勻橙子樣品，并稱取 10 g 樣品用于提取。 用 10 mL 乙腈通過(guò)劇烈振搖對(duì) 2 g 固體茶 樣品和 10 g 固體橙子樣品萃取 1 分鐘。 分別向各混合物中加入一袋安捷倫 EN 方 法萃取鹽（部件號(hào) 5982-6650），振搖 1 分 鐘，然后在 3000 ×g 下離心 5 分鐘。將 6 mL 茶葉上清液加入用于高色素 EN 方法 的 Agilent QuEChERS 分散 SPE 管（部件 號(hào) 5982-5356）中。同樣，將 6 mL 橙子 上清液加入用于含色素的水果和蔬菜 EN 的 Agilent QuEChERS 分散 SPE 管（部 件號(hào) 5982-5256）中。將兩者振搖 1 分 鐘，然后在 3000 ×g 下離心 5 分鐘。收 集所得上清液，并通過(guò) 0.45 µm 針頭過(guò) 濾器過(guò)濾。將之前制備的農(nóng)藥工作溶液以 相對(duì)原固體食物基質(zhì)干重 100 ng/g (ppb) 的濃度加入紅茶和橙子提取物中。用適當(dāng) 的基質(zhì)進(jìn)一步稀釋樣品，獲得 0.5、1、 5、10、20、50 和 100 ppb 七個(gè)濃度水 平的農(nóng)藥校準(zhǔn)樣品，需在進(jìn)樣前立即制 備，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣六次。將農(nóng)藥也加 入純乙腈中，比較 10 ng/g 濃度下兩種基 質(zhì)的信號(hào)回收率。

設(shè)備 使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng) 進(jìn)行色譜分離，該系統(tǒng)由以下模塊組成： • Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler， 配備樣品冷卻裝置 (G7167B, #100) • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B) 該液相色譜系統(tǒng)與配備安捷倫噴射流技術(shù) 離子源 (G1958-65638) 的 Agilent 6470B 三重四極桿 LC/MS (G6470B) 聯(lián)用。分別 使用 Agilent MassHunter 采集軟件（版 本 10.1）和 MassHunter 定量分析軟件 （版本 10.1）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。 方法 LC/MS 參數(shù)見(jiàn)表 1。極性、母離子和子 離子以及碰撞能量等 MRM 參數(shù)均從成熟 的現(xiàn)有方法中復(fù)制而來(lái)，并針對(duì)所選的弱 響應(yīng)分析物優(yōu)化了離子源條件。在快速極 性切換 dMRM 模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。將 2 µL 最終提取物進(jìn)樣至 LC/MS 系統(tǒng)。使 用忽略原點(diǎn)的線性擬合以及 1/x 加權(quán)進(jìn)行 校正曲線回歸。

結(jié)果與討論 動(dòng)態(tài) MRM 方法可實(shí)現(xiàn)快速分離 之前使用安捷倫 LC/TQ 儀器（型號(hào) G6470A）開(kāi)發(fā)的多殘留農(nóng)藥篩查方法可 直接用于 6470B 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng) (G6470B)。之前由于液相色譜柱和液相 色譜系統(tǒng)不同，保留時(shí)間略有偏移，因 此使用 MassHunter 軟件的動(dòng)態(tài) MRM 更 新選項(xiàng)自動(dòng)調(diào)整所有農(nóng)藥的保留時(shí)間。 圖 1 顯示了 244 種農(nóng)藥的疊加 MRM 色 譜圖，這些農(nóng)藥以 1 ng/g 的濃度加標(biāo)于 橙子提取物中，Y 軸放大了弱響應(yīng)農(nóng)藥的 信號(hào)。使用 14.5 分鐘液相色譜梯度，所 有化合物的 MRM 色譜圖都實(shí)現(xiàn)了基線分 離。大部分農(nóng)藥的定量濃度為默認(rèn) MRL 的 10%。

標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 在紅茶基質(zhì)和橙子基質(zhì)中，通過(guò)重復(fù)進(jìn) 樣 (n = 6) 7 個(gè)濃度在 0.5–100 ng/g 范圍 內(nèi)的校準(zhǔn)品得到校正曲線，評(píng)估多殘留 農(nóng)藥測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果表明 獲得了優(yōu)異的分析精密度（LLOQ 及以 上濃度下的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) < 20%） 和平均準(zhǔn)確度（LLOQ 及以上濃度下的計(jì) 算濃度/預(yù)期濃度介于 80%–120% 之間）。 橙子提取物中所有 244 種農(nóng)藥和紅茶提 取物中 230 種農(nóng)藥（共 244 種）的校正 曲線的相關(guān)系數(shù) (R2 ) 均大于 0.99。紅茶 中 14 種農(nóng)藥的低相關(guān)系數(shù) R2 (<0.99) 反 映出嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)。紅茶基質(zhì)中四種代 表性農(nóng)藥的校正曲線如圖 2 所示。

在本研究中，6470B 三重四極桿 LC/MS 可以檢出橙子基質(zhì)中的所有農(nóng)藥（信噪 比 > 3），濃度均低于 10 µg/kg，可用于 篩查方案。而紅茶基質(zhì)中除了一種化合 物（啶酰菌胺）外，其余所有化合物的 殘留量均小于或等于 10 µg/kg。用校正 曲線確定基質(zhì)中各農(nóng)藥的 LLOQ，定義為 6 次重復(fù)進(jìn)樣測(cè)得的低濃度，峰面積的 準(zhǔn)確度介于 80%–120% 之間，RSD 小于 20%。圖 3 顯示了紅茶基質(zhì)和橙子基質(zhì)中 農(nóng)藥化合物的 LLOQ。改進(jìn)后的 6470B 三 重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)可以定量紅茶和橙 子中的大多數(shù)目標(biāo)農(nóng)藥，濃度低于歐盟 委員會(huì)規(guī)定的默認(rèn) MRL 值 10 µg/kg[4]：紅 茶和橙子樣品中，分別有 239 種農(nóng)藥（共 244 種）和 243 種農(nóng)藥（共 244 種）的 LLOQ 小于或等于 10 ng/g。對(duì)于 US-EPA[3] 規(guī)定的具有特定容差的化合物，其定量濃 度均小于或等于 MRL 值。 食品基質(zhì)回收率 為評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)（離子抑制和增強(qiáng)），研 究人員在 10 µg/kg 的默認(rèn) MRL 下，比較 了基質(zhì)與純?nèi)軇┲械霓r(nóng)藥響應(yīng)，并計(jì)算出 農(nóng)藥回收率，如圖 4 所示。橙子基質(zhì)中 大約有 50% 的化合物實(shí)現(xiàn)了 SANTE 指導(dǎo) 原則要求的 80%–120% 范圍內(nèi)的回收； 紅茶基質(zhì)中大約有 40% 的化合物實(shí)現(xiàn)了 這一范圍內(nèi)的回收[2]。與預(yù)期一致，紅茶 基質(zhì)相較橙子基質(zhì)表現(xiàn)出更強(qiáng)的基質(zhì)效 應(yīng)。因此，通常建議采用基質(zhì)匹配校正曲 線分析有嚴(yán)重基質(zhì)效應(yīng)的樣品。由基質(zhì)空 白樣品的分析結(jié)果可知，雖然原始紅茶或 橙子樣品是從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買的“有機(jī)"產(chǎn) 品，但它們?nèi)院?12 種農(nóng)藥。

結(jié)論 利用超高效 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng) 與配備高靈敏度噴射流技術(shù)離子源 (AJS) 的 6470B 三重四極桿 LC/MS 聯(lián)用的 LC/MS 平臺(tái)，評(píng)估食品基質(zhì)中 244 種農(nóng) 藥殘留的定量性能。這套 6470B 三重四 極桿 LC/MS 系統(tǒng)還增加了 VacShield 和 經(jīng)過(guò)改進(jìn)的精密調(diào)諧的電子器件，易于維 護(hù)且性能穩(wěn)定，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行，同時(shí) 保持穩(wěn)定性和靈敏度。 本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)中使用了兩種食品基質(zhì)，紅茶 和橙子提取物。出人意料的是，在當(dāng)?shù)爻?市購(gòu)買的有機(jī)產(chǎn)品中也含有一些合成農(nóng) 藥。與純乙腈相比，兩種食品基質(zhì)的在分 析物響應(yīng)方面的差異均表現(xiàn)出明顯的基 質(zhì)效應(yīng)。即使在復(fù)雜基質(zhì)中，也有超過(guò) 98% 的目標(biāo)農(nóng)藥（共 244 種）的 LLOQ 處于或小于歐盟委員會(huì)規(guī)定的默認(rèn) MRL 值 10 µg/kg，證明該 LC/MS 平臺(tái)具有高 靈敏度。根據(jù)基質(zhì)中的農(nóng)藥響應(yīng)與純乙腈 中的農(nóng)藥響應(yīng)計(jì)算化合物回收率。橙子基 質(zhì)中大約有 50% 的化合物實(shí)現(xiàn)了 SANTE 指導(dǎo)原則要求的 80%–120% 范圍內(nèi)的回 收；紅茶基質(zhì)中大約有 40% 的化合物實(shí) 現(xiàn)了這一范圍內(nèi)的回收。